Characterization and control of the Vibrio vulnificus biofilm regulatory network = 비브리오패혈증균의 생물막 형성 조절 네트워크의 특성 규명 및 제어

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Many pathogenic bacteria form biofilms that are resistant to not only host immune defenses but also antibiotics. Vibrio vulnificus, a fulminating foodborne pathogen, also forms biofilms to colonize and persist in oyster which is a major infection route of the bacteria. Identification and characterization of the genes critical for biofilm formation is required to develop strategies for controlling biofilms in V. vulnificus. However, differential expression (DE) analysis of the genes in biofilm and planktonic cells under a single condition has limitations to identify the genes essential for biofilm formation. Thus, in this study, a machine learning algorithm named independent component analysis (ICA) was adopted to comprehensively identify the biofilm genes of V. vulnificus. ICA analyzed the large-scale transcriptome data of V. vulnificus cells under various biofilm and planktonic conditions and then identified a total of 72 sets of independently co-regulated genes, iModulons. Among the three iModulons specifically activated in biofilm cells, BrpT-iModulon mainly consisted of known genes of the regulon of BrpT, which is up-regulated by BrpR and functions as a transcription factor controlling biofilm formation in V. vulnificus. Interestingly, the BrpT-iModulon additionally contained two novel genes, VV1_3061 and VV2_1694, designated as cabH and brpN, respectively. cabH and brpN were shared in other Vibrio species and not yet identified by DE analyses. Genetic and biochemical analyses revealed that cabH and brpN are directly up-regulated by BrpT. The deletion of cabH and brpN impaired the robust biofilm and rugose colony formation. CabH, structurally similar to the previously known calcium-binding matrix protein CabA, was essential for attachment to the surface. BrpN, carrying an acyltransferase-3 domain as observed in BrpL, played an important role in exopolysaccharide production. Altogether, ICA identified two novel genes, cabH and brpN, which are regulated by BrpT and essential for the development of robust biofilms and rugose colonies of V. vulnificus. My next concern was about new control strategies which target biofilm formation of bacterial pathogens. To prevent biofilm formation of V. vulnificus, chemical libraries were extensively screened to identify a small molecule inhibiting the activity of BrpR, a master regulator for biofilm genes including brpT. Accordingly, the BrpR inhibitor BFstatin [N1-(2-chloro-5-fluorophenyl)-N3-propylmalonamide], with a half-maximal effective concentration of 8.01 μM, was identified. BFstatin did not interfere with bacterial growth or exhibit cytotoxicity to the human epithelial cell line. BFstatin directly bound to BrpR and interrupted its binding to the target promoter DNAs of the downstream genes. Molecular dynamics simulation of the interaction between BFstatin and BrpR proposed that BFstatin modifies the structure of BrpR, especially the DNA-binding domain. Transcriptomic analyses revealed that BFstatin reduces the expression of the BrpR regulon including the cabABC operon and brp locus which contribute to the production of biofilm matrix of V. vulnificus. By inhibiting matrix development, BFstatin diminished the biofilm levels of V. vulnificus in a concentration-dependent manner. The combined results suggest that BFstatin could be an anti-biofilm agent targeting BrpR, thereby rendering V. vulnificus more susceptible to host immune defenses and antibiotics.

국문 초록 (Abstract)

많은 병원성 세균은 숙주의 면역 방어뿐만 아니라 항생제에도 저항성을 가지는 생물막(biofilm)을 형성한다. 치사율이 높은 식중독균인 비브리오패혈증균 또한 생물막을 형성함으로써 이 병원균의 주된 감염 경로인 굴에 집락을 형성하고 잔존한다. 비브리오패혈증균에서 생물막 형성에 핵심적인 유전자들을 동정하고 특성을 규명하는 것은 생물막 형성을 제어할 전략을 개발하는 데 필요하다. 그러나, 단일 환경에서 생물막 세포와 부유(planktonic) 세포 간의 발현 차이를 분석하는 차등 발현(differential expression) 분석은 생물막 형성에 필수적인 유전자를 규명하는 데 한계가 있다. 따라서 본 연구에서는 비브리오패혈증균의 생물막 형성 유전자들을 포괄적으로 확인하기 위해 독립 성분 분석(independent component analysis)이라는 기계 학습 알고리즘을 적용하였다. 독립 성분 분석을 활용하여 다양한 생물막 및 부유 조건에서 유래한 비브리오패혈증균의 대규모 전사체 데이터를 분석한 결과, 총 72개의 독립적이며 공동으로 조절되는 유전자 집단인 iModulon들이 확인되었다. 그 중 생물막 조건에서 특이적으로 활성화된 세 개의 iModulon 가운데, BrpT-iModulon은 BrpR에 의해 발현이 증가하며 비브리오패혈증균의 생물막 형성을 조절하는 전사 조절자인 BrpT의 regulon이 주를 이루고 있었다. 흥미롭게도, BrpT-iModulon은 본 연구를 통해 각각 cabH와 brpN으로 명명된 유전자 VV1_3061과 VV2_1694도 포함하였다. cabH와 brpN은 다른 비브리오 종에서도 보존되어 있었으며, 차등 발현 분석으로는 생물막 형성에 관여하는 것으로 밝혀지지 않았던 유전자들이다. 유전적 및 생화학적 분석 결과, cabH와 brpN은 BrpT에 의해 직접적으로 발현이 활성화되었다. 또한, cabH와 brpN을 각각 결손시킨 돌연변이 균주는 생물막과 주름진 집락(rugose colony) 형성 능력이 저하되었다. CabH는 기존에 알려진 칼슘 부착 생물막 기질 단백질 CabA와 구조적으로 유사하며, 균주의 표면 부착에 필수적이었다. BrpN은 BrpL에서 관찰되는 아실기전이효소-3 도메인을 포함하고 있으며, 세포 외 다당류(exopolysaccharide) 생산에 중요한 역할을 수행하였다. 종합하면, 본 연구에서는 독립 성분 분석을 활용하여 BrpT에 의해 조절되며, 생물막과 주름진 집락 형성에 필수적인 비브리오패혈증균의 두 신규 유전자 cabH와 brpN을 규명하였다. 다음으로, 병원성 세균의 생물막 형성을 표적으로 하는 새로운 제어 전략에 대해 연구하였다. 비브리오패혈증균의 생물막 형성을 억제하는 방법으로, brpT를 포함한 생물막 형성 유전자들의 발현을 조절하는 핵심 전사 조절자인 BrpR의 활성을 저해하는 소분자 화합물을 발굴하기 위해 화합물 라이브러리를 광범위하게 스크리닝하였다. 그 결과, 반수효과량이 8.01 μM인 BrpR의 저해제 BFstatin[N1-(2-chloro-5-fluorophenyl)-N3-propylmalonamide]을 발굴하였다. BFstatin은 세균의 생장을 저해하지 않았으며, 인간 상피세포주에 대한 세포독성도 나타내지 않았다. BFstatin은 BrpR에 직접 결합하여 하위 유전자들의 프로모터 DNA와 결합하는 것을 방해하였다. BFstatin과 BrpR 사이의 상호작용에 대한 분자 동역학 전산모사(molecular dynamics simulation) 결과, BFstatin이 BrpR의 구조, 특히 DNA 결합 도메인을 변형시키는 것으로 예측되었다. 또한, 전사체 분석을 통해 BFstatin이 비브리오패혈증균에서 생물막 기질 생산에 관여하는 cabABC 오페론과 brp locus를 포함한 BrpR의 regulon의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. BFstatin 처리 시 생물막 기질 생산이 억제됨으로써 BFstatin 농도에 비례하여 생물막 형성이 감소하였다. 종합적으로, BFstatin은 BrpR을 표적으로 하는 항생물막 제제로 작용하여 비브리오패혈증균을 숙주의 면역 방어 및 항생제에 더 민감하게 할 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter I. Introduction 1
• I-1. Study Background 2
• I-1-1. Vibrio vulnificus and its pathogenicity 2
• I-1-2. Biofilm dynamics and lifestyle of V. vulnificus 8
• I-1-3. Regulation of V. vulnificus biofilm development 13
• I-1-4. Machine learning applications in biology 17
• I-2. Purpose of Research 21
• Chapter II. Identification of novel biofilm genes of Vibrio vulnificus by large-scale transcriptomic analysis 23
• II-1. Introduction 24
• II-2. Materials and Methods 28
• II-2-1. Generation of the input data set of ICA comprising the V. vulnificus transcriptome data 28
• II-2-2. Identification of iModulons using ICA 31
• II-2-3. Calculation of CEV of PCA and ICA 34
• II-2-4. Correlation analysis of the expression levels of the genes or the activities of the iModulons 34
• II-2-5. Prediction, modeling, and visualization of the protein structures 36
• II-2-6. Strains, plasmids, and culture conditions 36
• II-2-7. Generation and complementation of the deletion mutants 40
• II-2-8. RNA purification and qRT-PCR 43
• II-2-9. Protein purification and EMSA 43
• II-2-10. Quantification and visualization of the biofilms 44
• II-2-11. Colony morphology assay 45
• II-2-12. EPS analysis 45
• II-2-13. DE analysis 46
• II-2-14. Data analysis 47
• II-3. Results 48
• II-3-1. ICA identified 72 iModulons of V. vulnificus 48
• II-3-2. BrpT-iModulon contained cabH and brpN 61
• II-3-3. cabH and brpN are positively and directly regulated by BrpT 72
• II-3-4. CabH and BrpN are essential for biofilm and rugose colony formation 75
• II-3-5. CabH is crucial for surface attachment 80
• II-3-6. BrpN is involved in EPS production 83
• II-4. Discussion 85
• Chapter III. Identification of a small-molecule inhibitor of BrpR attenuating biofilm formation of Vibrio vulnificus 96
• III-1. Introduction 97
• III-2. Materials and Methods 100
• III-2-1. Strains, plasmids, and culture conditions 100
• III-2-2. High-throughput screening 100
• III-2-3. Verification of hit molecules and determination of the EC50 of BFstatin 102
• III-2-4. LDH release assay 102
• III-2-5. Protein purification, MST, and EMSA 103
• III-2-6. Protein structure prediction, molecular docking, and MD simulation 104
• III-2-7. RNA sequencing and analysis 105
• III-2-8. EPS analysis 106
• III-2-9. Colony morphology assay 107
• III-2-10. Quantification and visualization of the biofilms 107
• III-2-11. Data analysis 108
• III-3. Results 109
• III-3-1. Small molecules interfere with BrpR 109
• III-3-2. The BrpR inhibitor BFstatin impedes the activity of BrpR 116
• III-3-3. BFstatin interacts with BrpR to inhibit its binding to target promoter DNA 118
• III-3-4. BFstatin modifies the structure of BrpR 121
• III-3-5. BFstatin affects the expression of the BrpR regulon 124
• III-3-6. BFstatin interrupts the development of the biofilm matrix 131
• III-3-7. BFstatin suppresses the biofilm formation of V. vulnificus 134
• III-4. Discussion 136
• Chapter IV. Conclusion 141
• References 145
• 국문초록 176