Catalytic Investigation of a Cytochrome c-Type Cis/Trans Fatty Acid Isomerase from Pseudomonas putida KT2440 = 슈도모나스 푸티다 KT2440 유래 사이토크롬 c형 시스/트랜스 지방산 이성화효소 촉매특성 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Most natural and processed foods contain a diverse group of hydrophobic compounds called lipids, which include fatty acyls, acylglycerols, phospholipids, sphingolipids, waxes, sterols, and other water-insoluble species. Their physicochemical properties are influenced by the chemical structure of acyl chains such as carbon chain length, number/position of carbon-carbon double bonds, and geometric and positional configuration. Therefore, developing innovative catalysts for the effective and sustainable control of structures in dietary lipids is crucial, yet challenges persist, especially in managing cis/trans geometric isomerism of ethylene double bonds. Conventional methods based on radical reactions require harsh reaction conditions, reducing reaction yield and making them incompatible with foods. In this thesis, cis/trans fatty acid isomerase (CTI), a cytochrome c-type hemoprotein exclusively found in several Gram-negative bacteria, has been proposed as a practical solution to overcome this challenge. This unique enzyme, which is originally associated with the short-term resistance of bacteria to external environmental stress, remains the only known biocatalyst capable of directly controlling geometric isomerism in unsaturated lipids. However, no efforts have been made to repurpose it for biocatalytic applications, due to the limited knowledge available about its catalytic properties, protein structure, and mode of action.
First of all, a sophisticated analytical platform combining a reversed micelle reaction system and modified methodologies for fatty acid methylation and gas chromatography (GC) separation was constructed. Highly stable Aerosol-OT/isooctane reversed micelles in the presence of the periplasmic fractions from Pseudomonas putida KT2440 were formed with an R-value of 10. Using a cyanopropyl phase DB-FastFAME column, cis/trans isomers of three different monounsaturated fatty acids were separated with resolution factors over 1.34. Based on this assay, the CTI reaction was precisely monitored, and its kinetic parameters were determined. Its catalytic efficiency (kcat/Km) was evaluated as 1.62 × 102 M–1·sec–1 toward oleic acid as the model substrate. These advancements provide a methodological foundation for CTI-based biocatalyst research and application in food and lipid processing industries.
Secondly, a comprehensive biochemical characterization of wild-type and recombinant CTIs from P. putida KT2440 was conducted to investigate their catalytic properties and application potential. The wild-type CTI was isolated from the periplasmic fraction using a serial chromatographic purification process. To enable its mass production, the CTI gene from P. putida KT2440 was cloned into a pET26b(+)/pEC86 dual-expression system and heterologously expressed in Escherichia coli, achieving successful overexpression and heme incorporation. The recombinant CTI showed substrate specificity toward palmitoleic acid (C16:1, cis-Δ9), with the highest conversion rate (99.35 ± 2.25%) over cis-vaccenic acid (61.46 ± 0.06%) and oleic acid (26.29 ± 4.51%), along with substrate promiscuity with chain length and double bond position. Under determined optimum reaction conditions, its catalytic efficiency (kcat/Km) was evaluated as 6.79 × 102 M–1·sec–1 toward palmitoleic acid. These results confirm the functional equivalence of recombinant CTI with its wild-type counterpart and the establishment of a mass-production platform for industrial applications, supported by precise catalytic characterization including substrate specificity, optimum conditions, and kinetic parameters. These advancements provide theoretical and practical information for CTI as a promising industrial catalyst to control cis/trans isomerism of dietary lipids.
Finally, structural investigation on the catalytic mechanism of CTI from P. putida strains was performed to elucidate how the enzyme achieves substrate specificity/promiscuity toward monounsaturated fatty acids. Artificial intelligence-based biomolecular modeling revealed that the enzyme adopts a hexacoordinated octahedral heme c complex, covalently bound to the heme-binding motif (23CVACH27) and stabilized by proximal His27-Fe and distal Met146-Fe coordination within a largely solvent-exposed hydrophobic pocket. It discriminates substrates based on pocket size (20−23 Å in length) and entry tunnel geometry, with optimal alignment of the ethylene double bond at the heme center, while its substrate promiscuity is attributed to a spacious active site that accommodates substrate variations in alkyl chain length and double bond position. Moreover, the molecular binding conformations of three monounsaturated fatty acids with the catalytic domain of CTI were analyzed by molecular docking simulation. These results revealed that palmitoleic acid exhibited the highest docking confidence (c = +0.90) and SMINA binding affinity (–2.47 kcal/mol), with precise alignment of the double bond at the heme iron center. In contrast, cis-vaccenic acid and oleic acid exhibited lower docking confidences (c = –0.61 and –1.62, respectively), with less favorable alignment at the heme center, correlating with their low catalytic conversion. These findings provide structural insights into the catalytic mechanism of CTI, and a blueprint for developing CTI-based biocatalysts for industrial applications.
In conclusion, this thesis not only elucidates the catalytic characteristics of a unique cytochrome c-type CTI but also establishes its practical potential as a structurally and functionally defined biocatalyst for directly controlling geometric isomerism in lipids, particularly in food and lipid chemistry.

국문 초록 (Abstract)

천연 및 가공식품에는 지용성 화합물의 이질적인 집합체인 지질이 함유되어 있으며, 이들의 물리화학적 특성은 주로 아실 사슬의 탄소 사슬 길이, 탄소-탄소 이중결합 수 및 위치, 그리고 탄소-탄소 이중결합 기하학적 및 위치적 이성화 구조와 같은 화학적 구조에 의해 결정된다. 이에 따라, 식이성 지질의 구조를 효과적으로 제어할 수 있는 안전하고 혁신적인 기술 개발이 요구되어 왔지만, 탄소-탄소 이중결합의 시스/트랜스 기하학적 이성화 제어에는 여전히 많은 한계가 존재한다. 기존의 라디칼 반응 기반의 시스/트랜스 기하학적 이성화 제어 기술은 가혹한 반응 조건과 유독한 물질을 필요로 하기 때문에, 반응 수율이 낮을 뿐만 아니라 식품 적용에 적합하지 않다는 단점이 있다. 본 논문에서는 이러한 문제를 효과적으로 해결하기 위한 대안으로, 일부 그람음성균에서 발견되는 사이토크롬 c형 헴 단백질인 시스/트랜스 지방산 이성화효소(CTI)를 제안하였다. 해당 효소는 원래 세균의 단기 내성과 관련되어 알려졌으며, 불포화 지질 내 시스/트랜스 기하학적 이성화를 직접 조절할 수 있는 유일한 생체 촉매로 보고되었다. 그러나 촉매 특성, 단백질 구조 및 작용 기작에 대한 지식이 제한적이어서, 이를 산업 촉매로서 활용하려는 시도는 이루어지지 않아왔다.
먼저, 정밀한 CTI 반응 분석을 위해 신규의 역미셀 반응 시스템과 향상된 지방산 메틸화 및 기체크로마토그래피 분리법을 결합한 고도화된 효소 반응 분석 플랫폼을 구축하였다. 슈도모나스 푸티다 KT2440 균주의 막간 공간 분획을 사용하여, 매우 안정적인 Aerosol-OT/이소옥탄 기반 역미셀(R-값=10)을 제조하였으며, 사이아노프로필 상을 사용하는 DB-FastFAME 컬럼을 통해 세 종류의 단일불포화지방산의 시스/트랜스 이성질체를 1.34 이상의 분리해상도로 성공적으로 분리하였다. 이를 기반으로 CTI 반응을 정밀하게 모니터링하였고, 올레산에 대한 CTI의 촉매 효율(1.62 × 10² M⁻¹·sec⁻¹)을 성공적으로 도출하였다. 이러한 기술적 진보는 CTI 기반 생체 촉매 연구 및 식품·지질 산업에서의 적용을 위한 유용한 방법론적 기반을 제공한다.
다음으로, 슈도모나스 푸티다 KT2440 유래 야생형 및 재조합 CTI의 효소적 특성 분석을 수행하였다. 야생형 CTI는 다중 크로마토그래피 정제 과정을 통해 막간 공간 분획으로부터 성공적으로 분리하였고, pET26b(+)/pEC86 이중 발현 시스템을 이용하여 CTI 유전자를 대장균에서 이종 발현시킴으로써, 성공적인 헴 삽입과 과발현 기반 대량생산을 달성하였다. 재조합 CTI는 팔미톨레산(C16:1, cis-Δ9)을 기질로 사용하였을 때 가장 높은 전환율(99.35 ± 2.25%)을 나타냈으며, 시스-박센산(61.46 ± 0.06%) 및 올레산(26.29 ± 4.51%)에 비해 뛰어난 기질 특이성을 보였다. 또한, 사슬 길이 및 이중결합 위치에 대해 기질 난잡성도 확인되었다. 도출된 최적 반응 조건 하에서 팔미톨레산에 대한 촉매 효율은 6.79 × 10² M⁻¹·sec⁻¹로 평가되었다. 이러한 결과는 재조합 CTI가 야생형과 기능적으로 동등함을 입증하며, 대량생산 기반 구축 및 기질 특이성, 반응 조건, 효소 동역학 상수 등 정밀한 촉매 특성 분석을 통한 산업적 활용 가능성을 뒷받침한다.
마지막으로, 슈도모나스 푸티다 유래 CTI의 기질 특이성 및 난잡성을 포함한 작용 기작을 규명하기 위해 단백질 구조 분석을 수행하였다. 최신 인공지능 기반 생체분자 모델링을 통해, 본 효소가 헴 결합 모티프(23CVACH27)에 공유결합된 육배위 팔면체 구조의 헴 c 복합체를 가지며, 근위 히스티딘(His27-Fe)과 원위 메티오닌(Met146-Fe) 결합에 의해 안정화되어 있음을 확인하였다. 특별히, 효소의 활성 부위가 용매에 노출된 소수성 포켓 내에 존재하여, 포켓의 길이(20–23 Å)와 입구 터널의 기하 구조를 통해 기질 내 이중결합이 헴 중심에 정렬되도록 함으로써 기질을 선택적으로 인식한다는 사실을 밝혀내었다. 이때 활성 부위의 구조적 여유가 사슬 길이와 이중결합 위치의 다양성을 수용할 수 있어 기질 난잡성의 기반이 된 것으로 확인하였다. 더 나아가, 세 종류의 단일불포화지방산에 대한 분자 결합 시뮬레이션을 진행한 결과, 팔미톨레산이 가장 높은 결합 신뢰도(c=+0.90)와 SMINA 결합 에너지(–2.47 kcal/mol)를 나타내었으며, 이중결합이 헴 중심에 정밀하게 정렬되는 것으로 확인되었다. 반면, 시스-박센산과 올레산은 각각 낮은 결합 신뢰도(c=–0.61, –1.62) 및 비정렬 상태를 보였으며, 이는 낮은 전환율과 큰 상관성을 나타내었다. 이러한 결과는 CTI의 작용 기작에 대한 구조적 통찰을 제공함과 동시에, 산업적 활용을 위한 합리적 설계를 위한 청사진을 제시한다.
결론적으로, 독특한 사이토크롬 c형 CTI의 촉매 특성을 규명함으로써, 식품 및 지질 화학 분야에서 이를 기반으로 한 시스/트랜스 이성화 제어를 위한 구조적·기능적으로 정립된 유망한 생체 촉매 기술 개발에 크게 기여할 수 있을 것이라 기대한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents v
• List of Figures ix
• List of Tables xiv
• Chapter Ⅰ. General Introduction 1
• Ⅰ-1. Geometric Isomers of Unsaturated Fatty Acids 2
• Ⅰ-2. Health Effects of Dietary TFAs in Foods 4
• Ⅰ-3. Geometric Isomerization of Fatty Acids 6
• Ⅰ-4. Geometric Isomerases Acting on Fatty Acids 8
• Ⅰ-5. References 10
• Chapter Ⅱ. Development of Fast, Accurate, and Reproducible Methods for Evaluating Enzymatic Cis/Trans Isomerization of Monounsaturated Fatty Acids 16
• Ⅱ-1. Introduction 17
• Ⅱ-2. Materials and Methods 21
• Ⅱ-2-1. Materials 21
• Ⅱ-2-2. Periplasmic extraction 21
• Ⅱ-2-3. Enzyme assay 22
• Ⅱ-2-3-1. Aqueous buffer solution system 22
• Ⅱ-2-3-2. Reversed micelle system 23
• Ⅱ-2-4. Dynamic light scattering 24
• Ⅱ-2-5. Fatty acid methylation 24
• Ⅱ-2-6. Gas chromatography and data interpretation 25
• Ⅱ-2-7. Statistical analysis 26
• Ⅱ-3. Results and Discussion 28
• Ⅱ-3-1. Chromatographic resolution of fatty acid isomers 28
• Ⅱ-3-2. Construction of the reversed micelle reaction system 39
• Ⅱ-3-3. Validation of the reversed micelle reaction system 52
• Ⅱ-4. Conclusions 58
• Ⅱ-5. References 59
• Chapter Ⅲ. Characterization of Wild-type and Recombinant Cis/Trans Fatty Acid Isomerase from P. putida KT2440 66
• Ⅲ-1. Introduction 67
• Ⅲ-2. Materials and Methods 71
• Ⅲ-2-1. Materials 71
• Ⅲ-2-2. Plasmids, strains, and culture conditions 71
• Ⅲ-2-3. Wild-type enzyme isolation 72
• Ⅲ-2-3-1. Periplasmic extraction 72
• Ⅲ-2-3-2. Serial chromatographic protein purification 73
• Ⅲ-2-4. Molecular cloning and heterologous expression 75
• Ⅲ-2-4-1. Construction of plasmid and dual-transformation 75
• Ⅲ-2-4-2. Co-expression and enzyme purification 79
• Ⅲ-2-5. Enzyme assay 80
• Ⅲ-2-5-1. Aqueous buffer solution system 80
• Ⅲ-2-5-2. Reversed micelle system 81
• Ⅲ-2-5-3. Fatty acid methylation and gas chromatography 81
• Ⅲ-2-6. Statistical analysis 83
• Ⅲ-3. Results and Discussion 86
• Ⅲ-3-1. Catalyst characterization of wild-type CTI 86
• Ⅲ-3-1-1. Purification of CTI from P. putida KT2440 86
• Ⅲ-3-1-2. Catalytic properties of wild-type CTI 96
• Ⅲ-3-2. Catalyst characterization of recombinant CTI 108
• Ⅲ-3-2-1. Cloning of CTI gene from P. putida KT2440 108
• Ⅲ-3-2-2. Heterologous expression of recombinant CTI 118
• Ⅲ-3-2-3. Catalytic properties of recombinant CTI 124
• Ⅲ-4. Conclusions 136
• Ⅲ-5. References 137
• Chapter Ⅳ. Structural Inferences into the Catalytic Mechanism of a Cis/Trans Fatty Acid Isomerase from P. putida 144
• Ⅳ-1. Introduction 145
• Ⅳ-2. Materials and Methods 149
• Ⅳ-2-1. Materials 149
• Ⅳ-2-2. Plasmids, strains, and culture conditions 149
• Ⅳ-2-3. Molecular cloning and heterologous expression 150
• Ⅳ-2-3-1. Construction of plasmid and dual-transformation 150
• Ⅳ-2-3-2. Co-expression and enzyme purification 151
• Ⅳ-2-4. Enzyme assay 153
• Ⅳ-2-4-1. Reversed micelle system 153
• Ⅳ-2-4-2. Fatty acid methylation and gas chromatography 153
• Ⅳ-2-5. Computational biomolecular modeling 155
• Ⅳ-2-6. Molecular docking simulation 156
• Ⅳ-2-7. Statistical analysis 157
• Ⅳ-3. Results and Discussion 161
• Ⅳ-3-1. N-terminal signal peptide structure of CTI 161
• Ⅳ-3-2. Cyt c-type catalytic domain structure of CTI 168
• Ⅳ-3-3. Substrate specificity and promiscuity of CTI 177
• Ⅳ-3-4. Proposed catalytic mechanism of CTI reaction 185
• Ⅳ-4. Conclusions 191
• Ⅳ-5. References 192
• Abstract in Korean 198