Abemaciclib-Induced G1 Cell Cycle Arrest and Lysosomal Dysfunction in Canine Melanoma Cells : A Combined Approach with Fenbendazole = 개 흑색종 세포에서 아베마시클립에 의한 G1 세포주기 정지 및 리소좀 기능장애:펜벤다졸과의 병용 전략

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Canine melanoma is a highly aggressive tumor, accounting for approximately 7% of all canine malignancies. Over 97% of oral cases are malignant, with a poor prognosis and a median survival time of only 2–3 months if left untreated. Standard-of-care, including wide surgical resection and radiation therapy, is often hampered by the tumor’s anatomical location, particularly when it is surgically inaccessible, resulting in incomplete local control. At the time of diagnosis, a relatively high metastatic rate of 30–40% is observed, and the response to systemic chemotherapy is limited. The most effective single agent, carboplatin, showed an overall response rate (ORR) of only 28%. Regarding the ONCEPT DNA vaccine therapy, its availability is limited in Korea. Furthermore, although it has been shown to extend survival time as an adjuvant therapy for digital melanoma, multiple studies have reported that its use for oral melanoma post-surgery does not lead to a significant difference in prognosis.
Cell cycle dysregulation, including CDK4/6 copy number gains, is a known feature of canine melanoma, suggesting that cell cycle inhibition is a promising therapeutic avenue. Abemaciclib, a selective CDK4/6 inhibitor, is approved for the treatment of HR+/HER2- human breast cancer by inducing G1 phase arrest, but its efficacy in canine melanoma remains unexplored. This study aimed to investigate the antitumor effects of abemaciclib, as a monotherapy and in combination with fenbendazole, in canine melanoma models.
In vitro, abemaciclib inhibited proliferation and migration of canine melanoma cell lines (CMeC1, KMeC, LMeC, UCDK9M4, and UCDK9M5). Flow cytometry confirmed G1 phase cell cycle arrest in all cell lines; however, in UCDK9M5 cells, recovery of the G2/M population to control levels was observed at concentrations ≥ 2 µM. In morphological analysis with Diff-Quik staining and phase-contrast microscopy observation, all cell lines revealed extensive cytoplasmic vacuolization at abemaciclib concentrations ≥ 2.5 µM.
RT-qPCR analysis of abemaciclib treatment revealed that the expression of CCNA2 and CCNB1 was decreased in all cell lines. The expression of CCNE1 and CCNE2 was suppressed in all cell lines except LMeC; in contrast, LMeC showed CCNE1 levels similar to the control and a notable increase in CCNE2 expression. Regarding CCND1 expression, it was comparable to the control in UCDK9M4. However, in the other cell lines, its expression increased.
Western blot analysis confirmed the suppressed phosphorylation of the Rb protein in all cell lines following abemaciclib treatment. The protein expression of Cyclin A2 and Cyclin E1 decreased in CMeC1, UCDK9M4, and UCDK9M5. However, in KMeC and LMeC, the decrease in Cyclin A2 was not prominent. Cyclin E1 expression was increased in KMeC and LMeC. While no significant changes were observed in the levels of cleaved PARP, an apoptosis marker, the induction of autophagy was confirmed by the observed decrease in LC3B-I and increase in LC3B-II levels.
To investigate the origin of the cytoplasmic vacuoles induced by abemaciclib, a FITC-dextran uptake assay was performed. The absence of FITC within the vacuoles determined that they were not of extracellular origin. Furthermore, co-treatment with a V-ATPase inhibitor suppressed vacuole formation, supporting the possibility of a lysosomal origin. To assess the completion of the autophagic process, p62 protein levels were observed via immunofluorescence. A distinct accumulation of p62 was observed, suggesting that the autophagic flux was incompletely terminated.
When combined with fenbendazole, abemaciclib demonstrated a synergistic effect at specific concentration ranges, which was confirmed using the Highest Single Agent model in SynergyFinder. To determine if this synergy could be reproduced in vivo, UCDK9M5 cells, which showed the highest synergistic effect, were xenografted into BALB/c nude mice. Significant tumor growth inhibition was observed in both the abemaciclib monotherapy and the combination therapy groups compared to the control. In contrast, the fenbendazole monotherapy group showed a trend of tumor suppression that did not reach statistical significance.
Taken together, these results demonstrate that abemaciclib exerts its antitumor effects in canine melanoma by inducing G1 phase cell cycle arrest through the inhibition of Rb phosphorylation, while simultaneously triggering an incomplete autophagic flux associated with lysosomal dysfunction. Furthermore, the synergistic effects observed with fenbendazole suggest that the concurrent targeting of different cell cycle phases represents a effective therapeutic strategy for melanomas with cell cycle dysregulation.

국문 초록 (Abstract)

흑색종은 개 전체 종양의 약 7%를 차지하며, 특히 구강에 발생하는 경우 97% 이상이 악성으로 진단된다. 구강 흑색종은 치료하지 않을 시 2–3 개월에 불과한 예후가 불량한 종양이며, 표준 치료법으로는 광범위한 수술적 절제 및 방사선 치료가 적용되지만, 해부학적 위치로 인해 완전한 절제가 어려운 경우가 빈번하다. 진단 시점에서 이미 30–40%의 높은 전이율을 보임에도 불구하고, 화학요법에 대한 반응은 매우 제한적이며 가장 효과적인 단독 요법인 카보플라틴의 객관적 반응률(ORR,overall response rate) 역시 28%에 불과하다. ONCEPT DNA 백신 치료의 경우 국내에서 약물의 확보가 어려운 상황이며, 비록 지부 흑색종(digit melanoma)에서는 수술 후 ONCEPT DNA 백신을 보조 요법으로 사용할 경우 생존 기간 연장 효과를 보였지만, 다수의 연구에서 구강 흑색종의 경우 수술 후 병용 치료가 예후에 유의미한 차이를 만들지 못한 것으로 보고되었다. 이처럼 기존 치료법들이 한계를 보이는 상황에서 면역치료를 포함한 다양한 연구가 시도되고 있으나, 아직 확립된 치료법은 없는 실정이다. 따라서 개 구강 악성 흑색종의 예후를 개선하기 위한 새로운 치료 전략의 개발이 필요한 상황이다.
개 흑색종에서는 CDK4/6 의 유전자 복제 수 증가와 세포 주기 조절 이상이 보고된 바가 있다. 또한, 저자는 선행 연구에서 유세포 분석 및 면역형광염색을 통해 개 흑색종 세포주(KMeC, LMeC, UCDK9M3, UCDK9M4, UCDK9M5)에 펜벤다졸 처리 시
G2/M 세포주기 정지, 유사분열 파국(mitotic catastrophe) 또는 세포 노화(cellular senescence)가 발생하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 개 흑색종 세포가 내재된 세포 주기 이상을 가지고 있음을 시사하며, 이는 세포 주기 억제가 잠재적으로 효과적인 치료 전략이 될 수 있음을 의미한다. 아베마시클립은 선택적으로 CDK4/6 억제를 통해 Retinoblastoma 단백질의 인산화를 억제하고 E2F 전사인자의 전사를 방해하여 G1 세포주기 정지를 유도한다. 이러한 기전을 통해 호르몬 수용체 발현 양성이며 HER2 발현 음성인 사람 유방암(HR+/HER2-)에서 널리 사용되는 선택적 CDK4/6 억제제이다. 그러나 개 흑색종에서 이 약물의 항종양 효과에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 이에 따라 개 흑색종에서 선택적 CDK4/6 억제제인 아베마시클립의 치료 가능성을 확인하고자 본 연구를 진행하였다.
본 연구에서는 세포 및 마우스 이종 이식 모델을 활용하여 아베마시클립의 항암 효과를 평가하였고, 펜벤다졸과의 병용 효과 또한 분석하였다. 이를 위해 (CMeC1, KMeC, LMeC, UCDK9M4, UCDK9M5) 등 총 5 종의 개 흑색종 세포주에서 CCK-8 assay, wound healing assay 를 진행하여, 아베마시클립 처리 시 세포증식 억제 및 이동 억제 효과가 발생함을 확인하였다. 이와 더불어 위상차 현미경 관찰 및 Diff-Quik 염색을 통해 모든 세포주에서 아베마시클립 2.5 µM 이상 처리 시 세포질 내에 공포가 다수 발생하는 것을 확인하였다.
유세포 분석 결과, 실험에 사용된 모든 세포주에서 아베마시클립을 처리한 시 G1 세포주기 정지가 확인되었으나, UCDK9M5 세포주에서는 아베마시클립 2 µM 이상 처리 시 비정상적인 히스토그램과 함께 G2/M 기 세포 분율이 대조군 수준으로 회복되는 현상이 관찰되었다. RT-qPCR 분석에서는CCNA2 및 CCNB1 의 발현 감소가 모든 세포주에서 관찰되었다. CCNE1 및 CCNE2 의 발현은 LMeC 을 제외한 세포주에서 억제된 반면, LMeC 에서는 CCNE1 수준은 대조군과 유사하였고, CCNE2 의 발현은 오히려 증가하는 경향을 보였다. CCND1 의 경우 UCDK9M4 는 대조군과 발현 수준이 유사했으나 나머지 세포주에서는 모두 증가하는 경향을 나타냈다. Western blot 분석에서는 모든 세포주에서 아베마시클립 처리 시 Rb 단백질의 인산화 억제가 관찰되었다. CMeC1,UCDK9M4, UCDK9M5 에서 Cyclin A2 와 Cyclin E1 단백질 발현이 감소했으나, KMeC 과 LMeC 에서는 Cyclin A2 는 감소가뚜렷하지 않았고, Cyclin E1 은 오히려 증가하는 양상을 보였다.
세포자멸사(apoptosis)의 지표인 cleaved PARP 의 뚜렷한 변화는 없었으나, 자가포식(autophagy) 지표인 LC3 변화에서 LC3B-I 감소와 LC3B-II 증가가 관찰되어 자가포식이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
아베마시클립 처리에 의해 발생된 세포질 내 공포 기원을 규명하고자 FITC-dextran 섭취 평가를 진행했으며, 공포 내에 FITC 가 관찰되지 않아 공포가 외부로 유래하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한, V-ATPase 억제제와 아베마시클립을 병용 처리했을 때 공포 형성이 억제되어, 공포가 리소좀에서 기원했을 가능성을 뒷받침했다. 더 나아가 자가포식 흐름(autophagic flux)의 최종 진행 여부를 확인하기 위해 p62 의 단백질을 면역형광분석으로 관찰한 결과, p62 의 축적이 뚜렷하게 나타나, 자가포식 흐름이 불완전하게 종결됨을 시사하였다.
아베마시클립과 펜벤다졸을 병용 처리했을 때, 특정 농도범위에서 상승 효과(synergism)가 확인되었으며, 이는 SynergyFinder 를 이용한 HSA(Highest Single Agent) 모델분석을 통해 확인되었다. 가장 높은 상승효과를 보인 UCDK9M5
세포주를 마우스에 이종 이식하여, 해당 효과가 생체 내(invivo)에서도 재현되는지를 평가하였다. 아베마시클립 단독 및 펜벤다졸 병용 투여군에서 유의미한 종양 성장 억제 효과가 관찰된 반면, 펜벤다졸 단독 처리군에서는 종양 성장이 억제되는
경향은 있었으나 통계적 유의성을 보이지는 않았다. 이러한 결과들을 종합하면, 아베마시클립은 개 흑색종에서 Rb 단백질의 인산화 억제를 통해 G1 세포주기 정지를 유도하였고, 이와 동시에 리소좀 기능장애를 동반한 불완전한 자가포식 흐름을 유발하여 항종양 효과를 나타내었다. 또한, 아베마시클립과 펜벤다졸과의 병용의 상승효과는 세포 주기 이상을 보이는 흑색종에서 서로 다른 단계의 세포주기를 표적하는 억제제들의 병용이 효과적인 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents v
• Abbreviations ix
• List of Figures and Tables xi
• General Introduction 1
• Literature Review 5
• 1. Cell Cycle in Mammalian Cells 5
• 2. Role of Retinoblastoma Protein and E2F in Cell Cycle 14
• 3. CDK4/6 Inhibitors and Chemotherapy 18
• 4. Autophagy and Chemotherapy 23
• 5. Summary 29
• 6. Hypothesis and Objectives 31
• 6.1. Rationale and Knowledge Gaps 31
• 6.2. Hypotheses 32
• 6.3. Objectives 33
• Chapter I: Abemaciclib-Induced G1 Phase Cell Cycle Arrest and Senescence in Canine Melanoma Cells 34
• 1. Introduction 35
• 2. Materials and Methods 38
• 2.1. Cell culture and cell line authentication statement 38
• 2.2. Cell viability assay 39
• 2.3. Colony formation assay 39
• 2.4. Cell staining and morphology 40
• 2.5. Wound healing assay 40
• 2.6. Cell cycle analysis 41
• 2.7. Protein extraction and western blot analysis 42
• 2.8. Quantitative Real-Time PCR 43
• 2.9. Statistical analysis 44
• 3. Results 47
• 3.1. Reduction of cell viability and morphological alterations by abemaciclib 47
• 3.2. Induction of cytoplasmic vacuolation and cell flattening 52
• 3.3. Abemaciclib-mediated inhibition of cell migration 55
• 3.4. Inhibition of cell migration by abemaciclib 59
• 3.5. Induction of G1 cell cycle arrest by abemaciclib 63
• 3.6. Expression of cell cycle–related genes after abemaciclib treatment 66
• 3.7. Downregulation of cell cycle proteins and induction of autophagy by abemaciclib in canine melanoma cells 69
• 4. Discussion 72
• Chapter II: Abemaciclib-Induced Lysosomal Dysfunction and Synergistic Antitumor Effects of Its Combination with Fenbendazole in Vitro and in Vivo 78
• 1. Introduction 79
• 2. Materials and Methods 82
• 2.1. Dextran uptake assay 82
• 2.2. Inhibition of cytoplasmic vacuolization 82
• 2.3. Combination studies 83
• 2.4. Immunofluorescence analysis 84
• 2.5. In vivo study 85
• 2.6. Statistical analysis 86
• 3. Results 88
• 3.1. Abemaciclib-induced vacuolization and its suppression via V-ATPase inhibitors 88
• 3.2. Inhibition of autophagy completion by abemaciclib 91
• 3.3. Synergistic effects of abemaciclib and fenbendazole 95
• 3.4. Combination of abemaciclib and fenbendazole using a mouse xenograft model of canine melanoma 99
• 4. Discussion 104
• General Conclusion 108
• Future Directions 110
• References 112
• Appendix A 133
• Appendix B 137
• Appendix C 139
• Appendix D 143
• Appendix E 145
• 국문 초록 146