Tumor-selective mRNA-LNP delivery via antibody-apolipoprotein A1 fusion proteins and miRNA-responsive 3′UTRs

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Messenger RNA (mRNA)-based therapeutics have emerged as a promising strategy for cancer treatment, offering rapid development, scalable manufacturing, and the flexibility to encode diverse therapeutic proteins. Lipid nanoparticles (LNPs) have become the leading delivery platform for mRNA, providing efficient protection and intracellular delivery of nucleic acids. However, their clinical application remains limited by off-target effects and nonspecific accumulation in the liver, which can lead to unintended gene expression and toxicity. To overcome these limitations, I developed a tumor-targeted mRNA delivery platform that integrates receptor-mediated targeting, microRNA (miRNA)-responsive translational regulation, and combination gene therapy to improve specificity and efficacy. For targeted delivery to tumor cells, I developed the Grabber-Antibody (GrAb) system, in which the epidermal growth factor receptor (EGFR)-targeting antibody Panitumumab was genetically fused to Apolipoprotein A1 (ApoA1). This fusion protein spontaneously assembles on the surface of LNPs, forming EGFR-targeting LNPs (EGFRLNPs) without the need for chemical conjugation. To suppress off-target expression in hepatocytes, I engineered to include a 3′ untranslated region (3′UTR) containing binding sites for miR-122, a liver-specific microRNA. This design effectively reduced mRNA translation in hepatocyte-derived cells by over 80%, while maintaining expression in tumor cells with low miR-122 levels. For therapeutic application, mRNAs encoding the tumor suppressor p53 and the pro-apoptotic protein SMAC were co-delivered. This combination induced a dose-dependent decrease in cell viability in p53-null cancer cells and led to a synergistic enhancement of apoptosis compared to p53 alone. In conclusion, this study presents a modular mRNA delivery strategy that enables tumor-selective expression by combining EGFR-targeted delivery, miRNA-based translational control, and co-delivery of synergistic genes. These results demonstrate the potential of this platform to improve the specificity and therapeutic efficacy of mRNA-based cancer treatments.

국문 초록 (Abstract)

메신저 RNA(mRNA) 기반 치료제는 신속한 개발, 대규모 생산의 용이성, 다양한 치료 단백질 인코딩이 가능하다는 유연성을 바탕으로 암 치료 분야에서 유망한 전략으로 주목받고 있다. 특히, mRNA의 전달체로 지질 나노입자(Lipid Nanoparticles, LNPs)가 주요 플랫폼으로 활용되고 있다. 그러나 오프타깃 효과(off-target effect)와 간에서의 비특이적 축적에 따른 비의도적 유전자 발현 및 독성은 여전히 mRNA-LNP 치료의 주요 한계로 작용한다. 이를 극복하기 위해, 본 연구에서는 수용체 매개 표적화, 마이크로RNA(miRNA) 반응성 번역 조절, 병용 유전자 치료 전략을 통합한 종양 특이적 mRNA 전달 플랫폼을 개발하였다. EGFR을 발현하는 암세포에 선택적으로 mRNA를 전달하기 위해, EGFR 특이적 항체인 파니투무맙(Panitumumab)과 아포지단백 A1(Apolipoprotein A1, ApoA1)을 융합한 단백질(그랩항체)을 설계하였으며, 이는 별도의 화학적 접합 없이 LNP 표면에 자가조립되어 EGFR 표적 LNP(EGFRLNP)를 형성하였다. 본 플랫폼은 우수한 표적 결합 특이성과 전달 효율을 나타냈다. 또한, 간세포에서 높게 발현되는 miR-122의 결합 서열을 mRNA의 3′ 비번역 영역(3′UTR)에 삽입하여 간 특이적 오프타깃 발현을 효과적으로 억제하였다. 그 결과, 간 유래 세포에서는 mRNA 번역이 80% 이상 감소하였고, miR-122 발현이 낮은 종양세포에서는 안정적인 단백질 발현이 유지되었다. 치료 유전자로는 종양 억제 유전자 p53과 세포사멸 유도 단백질 SMAC의 mRNA를 병용하였으며, 이 조합은 p53 결실 암세포에서 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시키고, 단독 처리 대비 유의한 세포사멸 증가를 유도하여 시너지 효과를 보였다. 결론적으로, 본 연구는 EGFR 기반 표적화, miRNA 기반 발현 조절, 유전자 병용 전략을 통합함으로써 종양 특이적 mRNA 전달과 향상된 항암 효능을 동시에 실현할 수 있는 정밀 치료 전략의 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 6
• 2. 1. Cells 6
• 2. 2.Gene Synthesis and Plasmid Cloning 6
• 2. 3. Construction and Production of GrAb 8
• 2. 4. In Vitro Transcription of mRNA 9
• 2. 5. Preparation of mRNA-LNP 10
• 2. 6. RiboGreen assay 12
• 2. 7. Formation of GrAb-LNP 13
• 2. 8. SDS-PAGE analysis 13
• 2. 9. Ultracentrifugation 13
• 2. 10. Dynamic light scattering (DLS) 14
• 2. 11. Luciferase assay 14
• 2.11.1. Luciferase assay for In Vitro Cellular Uptake Assay 14
• 2.11.2. Luciferase Assay for In Vitro miRNA-Dependent Regulation 15
• 2. 12. Fluorescence activated cell sorting (FACS) 16
• 2. 13. Western Blot 16
• 2. 14. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) 18
• 2. 15. In Vitro Cell Growth Inhibition Assay 19
• 2. 16. Apoptosis assay 19
• 3. Results 21
• 3. 1. Construction and Characterization of Panitumumab-GrAb and EGFRLNP 21
• 3. 2. In vitro analysis of EGFR expression and receptor-mediated binding of EGFRLNPs 25
• 3. 3. In vitro evaluation of EGFRLNP-mediated functional mRNA delivery 29
• 3. 4. In vitro analysis of mRNA repression by miR-122responsive 3UTRs 32
• 3. 5. p53 mRNA Delivery via Engineered 3UTR and EGFRLNPs 36
• 3. 6. Evaluation of the synergistic anticancer effect of p53 and SMAC mRNA co-delivery via LNPs 40
• 4. Discussion 46
• Reference 49
• Summary (Korean) 52