Pomegranate extract inhibits the development of PCOS by suppressing the apoptosis and oxidation

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

As human's average lifespan increases, health, particularly women's health, has become an interesting scientific topic due to its relevance to overall well-being and reproductive capacity. Globally, 10% of reproductive women has polycystic ovaries or polycystic ovarian syndrome (PCOS). PCOS is known to be related to metabolic disorders such as obesity and insulin resistance. Despite its prevalence, the pathophysiology of PCOS is insufficiently understood, emphasizing the need for various research and proper animal models. In this study, we constructed PCOS mouse model via DHEA and therapeutic effect of pomegranate extract (Pg-hWE) was evaluated. Histological analysis demonstrated that Pg-hWE restored the presence of corpus luteum and reduced the number of atretic follicles, suggesting improved normal ovulation and decreased follicular degeneration. Immunoblotting analysis in uterine tissue showed that Pg-hWE decreased apoptosis-related markers such as BAX, cleaved caspase-3, and cleaved caspase-9. In ovarian tissue, Pg-hWE significantly downregulated mRNA expression of apoptotic and inflammatory markers (BAX, IL-6, TNF-α, and IFN-γ) while increasing anti-apoptotic Bcl-2. In addition, it regulated the expression of CYP11A1 and CYP17A1, genes involved in androgen biosynthesis, supporting its effect on hormonal regulation in PCOS. To link these in vivo effects to a molecular mechanism, we conducted in vitro experiments using CHO-K1 cell line. Pg-hWE reduced apoptosis and exhibited strong antioxidant capacity. Although these results demonstrate the therapeutic potential of Pg-hWE, the exact mechanisms remain unclear. Further mechanism studies are essential to fill the gap between in vivo and in vitro systems and may contribute to the development of novel treatment strategies for PCOS.

국문 초록 (Abstract)

인간의 기대 수명이 증가함에 따라 건강, 특히 여성 건강에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이는 전반적인 삶의 질은 물론 생식 기능과도 밀접하게 관련되어 있다. 다낭성 난소 증후군(PCOS)은 전 세계 가임기 여성의 약 10%에 영향을 미치며, 비만과 인슐린 저항성과 같은 대사 질환과 관련이 있다. 그럼에도 불구하고 PCOS 의 병태생리는 충분히 규명되지 않았으며, 이에 따라 신뢰할 수 있는 연구와 적절한 동물 모델의 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 DHEA (30 mg/kg)를 피하주사하여 마우스에 PCOS 를 유도하였고, 경구 투여한 석류 추출물 Pg-hWE (100mg/kg)의 치료 효과를 평가하였다. H&E 염색을 통한 조직학적 분석 결과, PghWE 처리군에서 황체의 수가 회복되고 위축된 난포(atretic follicle)의 수가 감소함으로써 배란 기능이 개선되고 난포 퇴행이 억제됨을 확인할 수 있었다. 자궁조직의 단백질 수준 분석에서는 Pg-hWE 처리 시 BAX, cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-9 등의 세포사멸 관련 지표가 감소했다. 난소 조직의 mRNA 분석에서도 BAX, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ 같은 염증 및 세포사멸 인자가 억제되고, 항세포사멸 인자인 Bcl-2 가 증가하는 효과가 나타났다. 또한, 안드로겐 생합성에 관여하는 CYP11A1 과 CYP17A1 유전자의 발현도 조절되어, 호르몬 조절 측면에서도 긍정적인 효과가 있음을 보여주었다. 이러한 생체 내 결과를 분자적 수준에서 뒷받침하기 위해 중국 햄스터 난소 유래 세포주인 CHO-K1 을 이용한 세포 실험을 수행했다. Annexin V/PI 염색을 활용한 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 Pg-hWE 가 세포사멸을 억제하고 항산화 능력을 갖는다는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 Pg-hWE 의 치료 가능성을 뒷받침하지만, 그 정확한 작용 기전은 아직 명확하지 않으며, 생체 내외 실험 간의 간극을 좁히기 위한 추가적인 메커니즘 연구가 필요해 보인다. 이는 향후 PCOS 치료 전략 개발에 중요한 단서를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 6
• 2.1 Materials 6
• 2.2 Animals 7
• 2.3 Animal experiment design 7
• 2.4 Pg-hWE (Pomegranate hot water extract) preparation 7
• 2.5 Mouse serum ELISA 8
• 2.6 Histological analysis 8
• 2.7 Mouse tissue quantitative real-time PCR analysis 9
• 2.8 Whole lysate preparation and immunoblotting analysis 10
• 2.9 ABTS assay 11
• 2.10 DPPH assay 12
• 2.11 Cell culture 12
• 2.12 Cell viability assay 13
• 2.13 CHO-K1 cell line quantitative real-time PCR analysis 13
• 2.14 Luciferase Reporter gene assay 15
• 2.15 ROS (Reactive oxygen species) generation assay 15
• 2.16 Annexin V/PI flow cytometry 16
• 2.17 Statistical analysis 16
• 3. Results 18
• 3.1. Pg-hWE alleviates the symptoms of polycystic ovarian syndrome 18
• 3.2. Pg-hWE regulates apoptosis factors, NF-κB elements, and antioxidant factors in uterus at protein levels 25
• 3.3. Pg-hWE alleviates PCOS by regulating androgen synthesis pathway related genes and inflammatory cytokines and by regulating apoptosis factors and antioxidant factors at the protein level in ovaries 30
• 3.4 Pg-hWE reduces apoptosis (cell death) in CHO-K1 cell line 35
• 3.5 Pg-hWE has antioxidant effects on CHO-K1 cell line 39
• 4. Conclusion and Discussion 46
• References 50
• 국문요약 (초록) 54