(The) mTOR/S6K1 signaling pathway regulates differentiation of human embryonic stem cells through organizing multicellular structure

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The mTOR/S6K1 signaling pathway is regulated by various factors such as growth hormones, amino acids, and glucose, and through its downstream pathways, it influences cell growth, proliferation, protein synthesis, and survival, playing a critical role in maintaining cellular function. Studies in mouse models have shown that disruption or dysregulation of the mTOR/S6K1 signaling pathway can impair developmental processes in multiple tissues, including the brain, heart, and pancreas. Furthermore, improper regulation of the mTOR pathway is also known to affect human brain development, contributing to conditions such as autism spectrum disorder and cognitive developmental delays.
Most research on the mTOR/S6K1 signaling pathway has been conducted in cancer cells, leading to the identification of many downstream effectors involved in cell proliferation, protein synthesis, and autophagy. However, how this pathway influences tissue development and differentiation through specific downstream mechanisms remains poorly understood. In this study, I investigated the role of the S6K1 signaling pathway in differentiation by generating S6K1-depleted human embryonic stem cells via gene editing and applying a stem cell-derived pancreatic beta cell differentiation protocol. I found that the loss of S6K1 suppresses the expression of transcription factors involved in epithelial–mesenchymal transition (EMT), thereby disrupting normal transitions in cytoskeletal organization and cell–cell junctions. This disruption impairs the formation of three-dimensional cellular architecture, reduces cellular diversity, and leads to a loss of cell populations responsible for expressing signaling molecules critical for pancreatic endocrine differentiation.
Furthermore, in brain organoids derived from human embryonic stem cells carrying the Smith-Kingsmore syndrome genotype, which is associated with mTOR hyperactivation, I observed increased organoid size and abnormal cellular organization around neural rosettes.
Through these investigations, this study demonstrates that the mTOR/S6K1 signaling pathway regulates cellular differentiation during three-dimensional development by modulating multicellular organization and structural arrangement.

국문 초록 (Abstract)

mTOR/S6K1 신호 전달 체계는 성장 호르몬, 아미노산, 당류 등 다양한 요인에 의해 영향을 받으며, 하위 조절 경로로 세포의 성장, 증식, 단백질 발현 및 생존에 영향을 미쳐, 세포의 기능 조절 유지에 매우 중요하다. mTOR/S6K1 신호 전달 체계가 붕괴되어 잘 조절되지 않았을 때, 뇌, 심장, 췌장 등 다양한 조직에서 발달 과정에 문제가 생긴다는 것이 쥐 실험에서 알려져 있었다. 또한, mTOR 신호 전달 체계의 잘못된 조절이 인간의 뇌 발달 과정에 영향을 미쳐 자폐 스펙트럼이나 인지 발달 장애를 일으킨 다는 점 역시 잘 알려져 있다.
mTOR/S6K1 신호 전달 체계의 연구는 대부분 암세포에서 많이 이루어져 왔으며, 이에 따라 세포의 증식, 단백질의 합성, 자가 포식과 관련된 하위 조절 인자들이 많이 밝혀져 왔다. 하지만, 실제 조직의 발달이나 분화 과정에서, mTOR/S6K1 신호 전달 체계가 어떤 하위 조절로 영향을 미치는 가에 대해서는 잘 연구되지 않았다. 본 연구에서는, 유전자 편집을 통해 S6K1 단백질이 결손된 인간 배아 줄기 세포로부터, 줄기 세포 유래 췌장 베타 세포를 분화시키는 프로토콜을 이용하여, S6K1 신호 전달 체계가 어떻게 분화에 영향을 미치는 가에 대해 밝혔다. S6K1의 결손에 따라, 상피-중간엽 전환에 관여하는 전사 인자들의 발현이 억제되고, 이에 따라 세포 골격, 세포 간 연접의 전환이 정상적으로 이루어지지 않아, 3차원 세포 구조 형성의 결핍이 발생한다. 이는, 세포의 다양성 감소로 이어지고, 감소된 세포들이 췌장 내분비 세포 분화에 중요한 신호 전달 물질을 발현하는 것으로 밝혀냈다. mTOR 신호 전달 체계가 과활성화 되는 Smith-Kingsmore 증후군 유전자형의 인간 배아 줄기 세포로 유도한 뇌 오가노이드에서, 오가노이드 크기의 변화와 신경 로제트 주위 세포 배열의 이상을 확인할 수 있었다.
위와 같은 연구들을 통해, 본 연구에서는 mTOR/S6K1 신호 전달 체계가 3차원 분화 과정 상에서 다세포의 배열, 구조 변화 등을 통해 분화를 조절한다는 사실을 밝혔다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1. Cytological roles and modulation of mTOR/S6K1 signaling pathway. 1
• 2. mTOR/S6K1 signaling pathway in tissue development and differentiation. 3
• 3. Pancreatic β cell development and stem cell derived β cells. 5
• 4. Human brain development and neuronal differentiation from pluripotent stem cells. 6
• 5. The role of multicellular organization in directing cell fate and differentiation. 8
• 6. Aim of this thesis 11
• Chapter 2. Materials and methods 13
• 1. Materials 13
• 2. Methods 17
• Chapter 3. Result 32
• 1. Abnormal Differentiation of Stem Cell Derived β Cells with S6K1 Depleted Human Embryo Stem Cells. 32
• 2. Decrease Cycling and ECM Rich cells in S6K1-/- Spheroids during Pancreatic Development. 44
• 3. Alterations in cytoskeleton and cell junction proteins and disruption of protein compartmentalization in the 3D cellular structure of S6K1-/- spheroids. 48
• 4. Gene Expression Patterns and Phenotypes Related to Bud Formation are Recapitulated in DLD1 3D Spheroids. 55
• 5. Differences in the expression of genes related to cellular architecture and tissue morphogenesis in DLD1 3D spheroids according to changes in S6K1 expression. 61
• 6. The population reduced in the pancreatic spheroids derived from the S6K1-/- line plays a role in secreting ligands important for endocrine development. 67
• 7. Analysis of the relationship between mTOR hyperactivation, multicellular structure, and neuronal development through Smith-Kingsmore syndrome modeling using brain organoids. 74
• Chapter 4. Discussion 84
• Chapter 5. References 88
• Chatper 6. 논문요약 101