MARCH2-mediated Lys63-linked polyubiquitination promotes metastasis by modulating the catalytic activity of TGF-β type I receptor

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

TGF-β signaling plays an important role in epithelial-mesenchymal transition (EMT), which is considered a crucial step in tumor progression. EMT promotes tumor migration, invasion, and metastasis. TGF-β ligands induce EMT through their downstream effectors. TGF-β signaling is transmitted inside the cell via the type II TGF-β receptor (TGFBR2) and the type I TGF-β receptor (ALK5). The TGF-β ligand binds to TGFBR2, which subsequently phosphorylates ALK5. ALK5, in turn, phosphorylates SMAD2/3, which are transcription factors that regulate the expression of TGF-β target genes, including SNAIL, SLUG, TWIST, and ZEB1/2—key EMT transcription factors (EMT-TFs). While the regulation of ALK5 stability has been well studied, the regulation of ALK5 kinase activity remains poorly understood. In this study, I identified MARCH2, an E3 ligase, as a regulator of ALK5 kinase activity. MARCH2 mediates K63-linked ubiquitination of ALK5 at the lysine 342/343 residue, promoting ALK5 activation. The knockdown of MARCH2 resulted in a downregulation of ALK5 kinase activity. Additionally, the ALK5 K342/343R mutant, which is defective in lysine 342/343 ubiquitination, lost its kinase activity. The knockdown of MARCH2 also inhibited EMT and migration by downregulating TGF-β signaling. Furthermore, the number of lung nodules decreased dramatically in mice injected with MARCH2 knockout (KO) tumor cells. Analysis of GSE and TCGA datasets revealed that MARCH2 expression was higher in tumor samples, and patients with higher MARCH2 expression had a poorer prognosis. In conclusion, MARCH2 mediates K63-linked ubiquitination of ALK5, which is essential for ALK5 kinase activity, and thus functions as a positive regulator of TGF-β signaling. Therefore, further insight into the function of MARCH2 may provide a novel strategy for blocking tumor progression and metastasis.

국문 초록 (Abstract)

TGF-β 신호전달은 암 발달의 중요한 단계로 여겨지는 epithelial-mesenchymal transition (EMT)에서 중요한 역할을 수행한다. EMT는 암의 이동, 침투 그리고 전이를 촉진시킨다. TGF-β 리간드는 하위의 효과기를 통해 EMT를 유도한다. TGF-β 신호는 type II TGF-β receptor (TGFBR2) and the type I TGF-β receptor (ALK5)를 통해서 세포내로 전달된다. TGF-β가 TGFBR2에 결합하면 ALK5를 인산화 시키고, ALK5는 SMAD2/3를 인산화 시켜서 SNAIL, SLUG, TWIST 그리고 ZEB1/2와 같은 EMT 전사인자 (EMT-TFs)들의 발현을 증가시킨다. 그동안 ALK5의 안정성에 대한 연구는 진행되었지만, ALK5의 인산화 효소 활성의 조절에 대한 연구는 많이 진행되지 않았다. 그리하여 이 연구에서는 유비퀴틴화 효소인 MARCH2에 의한 ALK5의 활성 조절을 연구하였다. MARCH2는 ALK5의 342/343 리신 잔기에 K63 유비퀴틴화를 조절하여 ALK5의 활성도를 조절한다. MARCH2를 결핍시키면 ALK5의 활성도가 떨어지고, 유비퀴틴화가 일어나지 않는 K342/343R 돌연변이는 인산화 효소의 능력을 대부분 잃게 된다. MARCH2를 결핍시면 TGF-β 신호전달을 저해하여 EMT와 암 전이가 잘 일어나지 않는다. 더욱이 MARCH2가 knockout 된 암 세포는 쥐에서 폐로의 암 전이가 잘 일어나지 않는다. GSE와 TCGA 데이터를 통해서 MARCH2가 암 환자의 샘플에서 발현이 높은 것과 예후가 좋지 않은 것을 확인하였다. 결론으로, MARCH2는 ALK5의 K63 유비퀴틴화를 조절하여 ALK5의 활성을 조절하며 TGF-β 신호의 양성조절자로 활동한다. 그러므로 MARCH2의 기능에 대한 연구는 암 발달과 전이를 막는 전략을 제공할 것을 기대한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. INTRODUCTION 1
• Chapter 2. MATERIALS AND METHODS 4
• Chapter 3. RESULTS 13
• 1. MARCH2 regulates TGF-β signaling pathway 13
• 2. MARCH2 interacts with ALK5 16
• 3. TGF-β mediates interaction between ALK5 and MARCH2 21
• 4. MARCH2 regulates ubiquitination of ALK5 24
• 5. MARCH2 regulates the kinase activity of ALK5 34
• 6. ALK5 K342/343R mutation impairs TGF-β signaling 35
• 7. Depletion of MARCH2 inhibits a migratory and metastatic ability of tumor 40
• 8. ALK5 K342/343R mutant impairs migratory and metastatic ability of tumor 41
• 9. The expression level of MARCH2 is upregulated in tumor patients 45
• Chapter 4. DISCUSSION 50
• References 53
• 논문요약 57