Affinity-based site-selective antibody conjugation and payload phosphorylation to enhance ADC safety

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Antibody-drug conjugates (ADCs) have emerged as transformative modality in targeted cancer therapy by combining the antigen specificity of monoclonal antibodies with potent cytotoxic payloads linked via chemically stable linkers. The overarching goal in ADC development is to expand the therapeutic index (TI) by reducing the minimum effective dose (MED) through tumor-selective delivery and increasing the maximum tolerated dose (MTD) by minimizing off-target toxicity. Despite this promise, many clinically approved ADCs still fall short of achieving substantial TI improvements, primarily due to on-target toxicity from antigen expression in healthy tissues and off-target toxicity resulting from linker instability and nonspecific payload uptake.
Among these factors, linker stability significantly influences an ADC's safety profile and is predominantly determined by antibody conjugation chemistry. Traditional conjugation methods exploit endogenous cysteine or lysine residues on antibodies. Cysteine-based conjugation via maleimide chemistry, while widely utilized, suffers from instability due to retro-Michael reactions under in vivo conditions. In contrast, lysine-based conjugation forms stable isopeptide bonds through amide coupling with activated esters, providing greater physiological stability. However, precise site-selective modification remains challenging due to antibodies typically having 70 to 90 lysine residues.
To overcome this limitation, a novel affinity-based site-selective conjugation was developed using an affinity ligand that specifically binds to the CH2-CH3 interface of human IgG1. This ligand strategically positions an acyl donor in proximity to Lys248 on human IgG1, enabling selective acyl transfer through a proximity-driven mechanism. The conjugation reaction follows pseudo first-order kinetics, ensuring precise modification at a single lysine residue and minimizing off-target reactions. This strategy results in homogeneous ADCs with enhanced conjugation stability and improved pharmacokinetic properties, providing a robust platform for next-generation ADC development.
Furthermore, to mitigate off-target toxicity associated with payload hydrophobicity, a phosphate-based soluble prodrug strategy is employed. The introduction of a phosphate moiety increases aqueous solubility and markedly reduces nonspecific membrane interactions, particularly those mediated by macropinocytosis. Following internalization into tumor cells, endogenous phosphatases cleave the phosphate group, thereby releasing the active cytotoxic payload in its functional form. This prodrug approach enhances systemic tolerability while maintaining antitumor efficacy, offering a versatile and broadly applicable solution to address the physicochemical limitations of hydrophobic payloads.

국문 초록 (Abstract)

항체-약물 복합체(ADC)는 항체의 표적 특이성과 세포독성 약물을 결합하여, 암세포를 선택적으로 제거할 수 있는 차세대 정밀 항암제로 주목받고 있다. ADC 개발의 궁극적인 목표는 종양 선택적 약물 전달을 통해 최소 유효 용량 (MED)을 감소시키고, 비표적 독성을 최소화함으로써 최대 허용 용량 (MTD)을 증가시켜 치료 지수(TI)를 확장하는 데 있다. 그러나 실제 임상에서 많은 ADC들은 이론적으로 기대되는 TI의 확장을 달성하지 못하였으며, MTD는 기존 화학항암제와 유사한 수준에 머무는 경우가 많다. 이는 크게 두 가지 요인, 표적 항원이 정상 조직에도 발현되는 데에서 기인하는 on-target toxicity와, 링커 불안정성과 약물의 소수성으로 인해 발생하는 off-target toxicity에 기인한다. 본 연구는 이러한 제한점을 극복하고 차세대 ADC로써 안전성과 약물의 효능을 향상시키기 위해, 위치선택적 접합 기술과 약물의 수용성을 개선한 prodrug 전략을 개발하였다. 먼저, 접합 위치의 정밀한 제어를 위해 인간 IgG1 항체의 CH2–CH3 경계에 위치한 Lys248에 강하게 결합하는 Fc-III cyclic peptide 기반의 친화성 리간드를 설계하고, O-acyl hydroxamate 유도체를 도입하여 아실화를 유도하였다. 또한, 항체에 비공유적으로 결합한 후 근접성에 기반한 아실 전이를 유도하는 affinity-based catalyst를 개발하여, 동일한 리간드가 반복적으로 반응에 참여할 수 있는 촉매적 시스템을 구축하였다. 이러한 전략은 기존 Cys 또는 Lys 기반의 무작위 접합이 가진 비균일성과 불안정성 문제를 해결하고, 안정적인 isopeptide 결합 형성을 통해 ADC 균질성과 링커 안정성을 크게 향상시켰다.
또한, off-target toxicity의 주된 원인 중 하나인 약물의 소수성 문제를 해결하기 위해, 수용성을 향상시킨 prodrug 전략을 개발하였다. 특히 Exatecan 구조에 phosphate와 β-glucuronide 기능단을 도입하여 약물의 소수성을 효과적으로 마스킹하였으며, 이로 인해 약물은 순환계 내에서 비활성화된 형태로 존재하면서도 종양 미세환경 내의 특이적 효소(예: phosphatase 또는 β-glucuronidase)에 의해 선택적으로 활성화되는 특징을 지닌다. 이 전략은 기존의 hydrophobic payload가 유도하던 비표적 세포의 macropinocytosis 기반 흡수를 현저히 줄이며, 전신 독성을 낮추고 종양 내 선택성을 향상시키는 데 기여하였다. Pro-prodrug 형태의 Exatecan은 기존 약물 대비 월등한 수용성을 보였으며, HIC-HPLC 분석에서 retention time이 의미 있게 감소하였고, 높은 DAR에서도 aggregation이 억제되었다. 이 두 가지 전략은 항체의 엔지니어링 없이도 적용 가능하고, 다양한 payload 및 적응증에 확장될 수 있어 차세대 ADC 설계에 있어 실용성과 범용성을 갖춘 전략으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. Historical Overview of Antibody-Drug Conjugates (ADCs) 1
• 1.2. Current Limitations of ADCs 3
• 1.3. Current Strategies to Expanding the Therapeutic Index (TI) of ADCs 6
• 1.3.1. Antibody 6
• 1.3.1.1. Bispecific antibody 7
• 1.3.1.2. Probody technology 10
• 1.3.1.3. Nanobody 12
• 1.3.1.4. Anti-payload antibody 14
• 1.3.2. Linker 17
• 1.3.2.1. Site-specific conjugation methods with antibody mutations 18
• 1.3.2.2. Site-selective off-the shelf antibody conjugation technologies 25
• 1.3.2.3. Hydrophobicity shielding strategies 29
• 1.3.3. Payload 31
• 1.3.3.1. Prodrug and pro-prodrug 33
• 1.3.3.2. Rapid and efficient payload release chemistry 36
• 1.3.3.3. Diverse payload modality 38
• 1.4. Development of Affinity-Based Linkers for Site-Selective Antibody Labeling 40
• 1.5. Development of a Phosphate-Based Soluble Exatecan Pro-Prodrug 42
• Chapter 2. Results and Discussion 43
• 2.1. Fc-binding O-Acyl Hydroxamate Reagents for Site-Selective Antibody Labeling 43
• 2.1.1. Design and synthesis of Fc-binding O-acyl hydroxamates (OAHs) 43
• 2.1.2. Reactivity and stability of Fc-binding OAHs affinity labels 47
• 2.1.3. Cross-linking test of Fc-binding OAHs with trastuzumab 50
• 2.1.4. Reaction kinetics analysis of Fc-binding OAH 7g 52
• 2.1.5. Binding site analysis of trastuzumab-Fc-binding OAH 7g 54
• 2.1.6. Application of Fc-binding OAH for site-selective ADC construction 58
• 2.1.7. Biological evaluation of trastuzumab-Fc binding OAH 62
• 2.2. Affinity-Based Catalysts for Site-Selective Antibody Labeling 65
• 2.2.1. Design and synthesis of affinity-based catalysts and acyl donors 65
• 2.2.2. Cross-linking test of affinity-based catalysts with trastuzumab 70
• 2.2.3. Biological evaluation test of trastuzumab-MMAE ADC 84
• 2.3. Phosphate-Based Soluble Exatecan Pro-Prodrug 88
• 2.3.1. Design and synthesis of exatecan prodrug and pro-prodrug 88
• 2.3.2. Conjugation of prodrug and pro-prodrug to CLDN18.2 mAb 92
• 2.3.3. Hydrophobicity comparison between exatecan prodrug and pro-prodrug 93
• Chapter 3. Conclusions 95
• Chapter 4. Materials and Methods 96
• 4.1 General Information 96
• 4.1.1 Chemicals and antibody 96
• 4.1.2. Purification of small molecules and peptides 97
• 4.1.3. Intact mass analysis of ADCs 97
• 4.1.4. Binding site analysis using in-solution digestion 97
• 4.1.5. Instruments 97
• 4.1.6. Instrumental parameters 98
• 4.1.7. Mass determination 99
• 4.2. Synthetic Methods 101
• 4.3. Products Identification 120
• References 155
• 논문 요약 165