Divergent β-adrenergic receptor signaling across species : implications for brown adipocyte thermogenesis

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

G protein-coupled receptors (GPCRs) can elicit multiple intracellular signaling pathways by primarily coupling with G proteins (Gα, Gβ and Gγ subunits) or β-arrestin upon activation. Beta-adrenergic receptors(β-ARs), a subset of GPCRs, are well known for their regulatory roles in brown adipose tissue. Under cold exposure or ligand stimulation, β-ARs mediated coupling to Gαs and enhanced cAMP production, leading to thermogenesis. And little is known about the potential coupling of β-ARs to non-Gαs proteins. Recently, a comprehensive understanding of downstream signaling with Gα subunits has received attention as a broad approach to discover novel signaling partners beyond established physiological mechanisms. Here, using BRET-based biosensors known as TRUPATH, we dissected the ability of the endogenous agonist norepinephrine and the synthetic agonist isoproterenol to couple 14 different Gα subunits through human and rodent β-ARs. We demonstrated that (i) endogenous and synthetic agonist activated distinct Gα protein signaling repertoires, (ii) humans and mice β-ARs engage different signaling partners, with a broader range of signaling observed in mice, and (iii) novel Gαi coupling, especially in mice, affects the brown adipose tissue thermogenesis. Our study highlights the importance of capturing the full range of Gα protein partners of GPCRs to gain a complete understanding of downstream signaling and physiological mechanisms. Furthermore, the observed species-specific differences or ligand-dependent effects in G protein coupling between rodents and humans highlight the necessity of careful ligand selection and validation in preclinical animal studies. Lastly, exploring the unique physiological roles and mechanisms of the novel Gαi/o family coupling, particularly in mice, will be an interesting area for further research.

국문 초록 (Abstract)

G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 활성화 시 G 단백질 또는 β-arrestin과 결합하여 다양한 세포 내 하위 신호 전달 경로를 유도한다. GPCR에 속하는 베타 아드레날린 수용체(Beta-adrenergic receptor, β-AR)는 갈색 지방 조직의 기능을 조절한다고 잘 알려져 있다. 추위에 노출되거나 리간드 자극을 받을 때, 베타 아드레날린 수용체는 Gαs와 결합하여 cAMP 생성을 증가시키고, 이를 통해 열생성 (thermogenesis)을 유도한다. 그러나 베타 아드레날린 수용체의 Gαs 외 다른 Gα 단백질과의 결합에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 최근, 생리적 메커니즘의 정립뿐만 아니라 새로운 신호 전달 파트너를 발견하기 위한 포괄적인 Gα-소단위 신호 전달 연구가 주목받고 있다. 그렇기에 본 연구에서는 TRUPATH라는 BRET 기반 바이오센서를 사용하여 내인성 작용제 노르에피네프린과 합성 작용제 아이소프로테레놀을 통해 사람과 설치류의 베타 아드레날린 수용체가 14가지 Gα-소단위와 결합하는 능력을 분석했다. 그 결과, (i) 내인성 작용제와 합성 작용제는 서로 다른 Gα-소단위 단백질 신호 레퍼토리를 가지고 (ii) 쥐에서 더 광범위한 신호 레퍼토리가 관찰되어, 인간과 쥐 또한 서로 다른 신호 전달 파트너를 가지며, (iii) 특히 쥐에서 발견된 새로운 Gαi-소단위와의 결합은 갈색 지방 조직의 열생성에 영향을 미친다는 것이 확인되었다. 본 연구는 GPCR의 다양한 신호 전달 및 생리적 메커니즘을 완전하게 이해하기 위해 Gα-단백질 파트너와의 결합을 확인하는 실험의 필요성을 강조한다. 또한, 설치류와 인간 사이에서 관찰된 G 단백질 결합의 종 특이적 차이와 리간드 특이성은 동물 실험에서 신중한 리간드 선택과 철저한 검증이 필요함을 시사한다. 마지막으로 설치류에서 발견된 Gαi/o와의 새로운 결합은 그것에 기반으로 한 새로운 생리적 역할과 메커니즘을 탐구할 중요한 연구 과제로 제시된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1 G-protein coupled receptors 1
• 1.2 Beta-adrenergic receptors (ADRBs) in adipocytes 4
• 1.3 Research aims 7
• 2. Materials and Methods 8
• 2.1 Chemicals 8
• 2.2 Cell culture 8
• 2.3 GloSensor cAMP Assay 8
• 2.4 BRET2 (TRUPATH) assay 9
• 2.5 Brown adipocyte culture 10
• 2.6 Western blotting 11
• 2.7 Statistical analysis 12
• 3. Results 13
• 3.1 cAMP response of ADRB1/2/3 stimulated with norepinephrine and isoproterenol 13
• 3.2 14 Gα-protein coupling of human ADRB1-3 stimulated with norepinephrine and isoproterenol 18
• 3.3 14 Gα-protein coupling of mice ADRB1-3 stimulated with norepinephrine and isoproterenol 30
• 3.4 Inhibiting Gαi/o enhances norepinephrine-regulated brown adipocyte ADRB3-Gαs-PKA signaling and thermogenesis but not by isoproterenol. 42
• 4. Discussion 46
• References 50
• 논문요약 55