Molecular Mechanisms of Rate-limiting Enzyme Families, DXS and PSY, in Regulating Terpene Biosynthesis in Rice

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Plant terpenoids, the largest and most diverse group of secondary metabolites, play key roles in photosynthesis, growth regulation, respiration, and environmental response. Terpenoid biosynthesis initiates with isopentenyl diphosphate (IPP, C5) and its isomer dimethylallyl diphosphate (DMAPP, C5), derived from either the cytosolic mevalonate (MVA) pathway or the plastidial 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway. Condensation of two building blocks generate various terpenoids — mono- (C10), sesqui- (C15), di- (C20), tri- (C30), tetra- (C40), and polyterpenes (C>45). Carotenoids, tetraterpenes, are synthesized through a series of enzyme reactions in the carotenoid biosynthetic pathway, primarily utilizing GGPP (C20) as the precursor, which is derived from MEP pathway followed by successive prenyltransferase actions. The first-step enzymes of the MEP and carotenoid pathways, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) and phytoene synthase (PSY), are known as rate-limiting enzymes, present in multiple copies and localized to plastoglobules (PGs) within plastids. These enzymes enable targeted regulation within subfamilies, critical for modulating terpene metabolism and advancing metabolic engineering strategies in plants.
In chapter 1, we aimed to elucidate the functional differences among the rice DXS isoforms (OsDXSs) concerning their structure, tissue-specificity, and regulatory roles. Rice (Oryza sativa) possesses three DXSs (OsDXS1, OsDXS2, and OsDXS3) classified into distinct clades, with OsDXS1 and OsDXS2 being closely related, while OsDXS3 is more distantly related. Structure-based protein clustering revealed that OsDXS1 and OsDXS2 diverged early in the evolutionary lineage, with OsDXS3 classified as an outgroup. Consistent with this, enzyme activity assay in lycopene-producing E. coli showed that OsDXS1 and OsDXS2 had high activity levels, while OsDXS3 was nearly inactive. Subcellular localization studies using rice protoplasts indicated that all three proteins were localized to chloroplasts but exhibited different targeting patterns: OsDXS1 and OsDXS2 were associated with PGs, whereas OsDXS3 localized to the stroma. Promoter analysis further demonstrated distinct expression patterns: OsDXS1 was expressed in photosynthetic tissues, floret, and germinating seedlings, but not in seeds; OsDXS2 was primarily found in leaf veins and seed scutella; and OsDXS3 was expressed in leaves during the reproductive stage and in seed embryos. In functional studies, overexpression of OsDXS1, 2, and 3, both individually and in combination with a β-carotene producing recombinant gene (synthetic stPSY-2A-stCrtI, stPAC), showed no significant differences in photosynthetic organs. However, carotenoid levels were enhanced in seeds for both OsDXS1-stPAC and OsDXS2-stPAC. Knockout studies revealed distinct phenotypes: osdxs1 resulted in albino leaves, osdxs2 caused blackened seeds, and osdxs3 displayed normal phenotype. The lethal phenotype of osdxs1 was completely complemented by only OsDXS1 overexpression, indicating no functional redundancy among three DXS isoforms in rice. Finally, protein-protein interactions revealed that three OsDXSs can form homo- and heterodimers, with varying enzymatic activities among the heterodimers. Overall, this study elucidates the functional differences and interactions within the rice DXS family.
In chapter 2, we intended to elucidate the PG-targeting mechanism of rice PSY2 (OsPSY2) within plastids. We investigated the effects of three hydrophobic regions (HRs) in OsPSY2: HR1 (1–45th aa), HR2 (46–80th aa), and HR3 (229–247th aa). Our finding indicates that the crucial sequence for chloroplast import residue within HR1 (31–45th aa), while stromal cleavage occurs at a specific alanine residue in HR2 (64th aa), confirming that the N-terminal 64-aa region functions as the transit peptide (Tp). HR2 exhibits a weak PG-targeting signal, as evidenced by both synchronous and asynchronous localization patterns in the PGs and stroma of chloroplasts. In contrast, HR3 demonstrates a strong PG-targeting function, ensuring the necessary positional specificity to prevent non-accumulation, aggregation, or misfolding of proteins. In this study, we identified a Tp and two transmembrane domains within the three HRs of OsPSY2, proposing a spontaneous pathway for its PG translocation, with a conformation embedded in the PG monolayer. In conclusion, we unveiled the PG-targeting mechanism of OsPSY2, providing insights into translocation strategies for specific suborganelles within plastids.
This study uncovered the distinct regulation of subfamilies and their targeting to metabolic sites involved in terpene metabolism in rice, providing valuable insights into plant terpene metabolism and potential approaches for crop biotechnology.

국문 초록 (Abstract)

식물의 터페노이드는 가장 크고 다양한 2차 대사산물 그룹으로, 광합성, 성장 조절, 호흡, 환경 반응 등에서 중요한 역할을 합니다. 터페노이드 생합성은 아이소펜테닐 이인산(IPP, C5)과 그 이성질체인 다이메틸알릴 이인산(DMAPP, C5)으로 시작되며, 이는 세포질의 메발론산(MVA) 경로 또는 plastid의 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-인산(MEP) 경로에서 유래됩니다. 두 빌딩 블록의 응축 반응으로 여러 종류의 터페노이드가 생성되며, 모노-(C10), 세스퀴-(C15), 다이-(C20), 트라이-(C30), 테트라-(C40), 폴리터펜(C>45) 등이 이에 해당합니다. 테트라터펜으로 알려진 카로티노이드는 주로 MEP 경로에서 유래한 GGPP(C20)를 전구체로 사용하여 카로티노이드 생합성 경로에서 일련의 효소 반응을 통해 합성됩니다. MEP 및 카로티노이드 경로의 첫 번째 단계 효소인 1-디옥시-D-자일룰로스 5-인산 합성효소(DXP synthase, DXS)와 파이토엔 합성효소(Phytoene synthase, PSY)는 속도 제한 효소로 알려져 있으며, 여러 카피로 존재하고 plastid 내 플라스토글로불(Plastoglobule, PG)에 위치합니다. 이러한 효소들은 하위계통(subfamily) 내에서의 특정 조절을 가능하게 하며, 터펜 대사의 조절과 식물 대사 공학 전략의 발전에 중요한 역할을 합니다.
제1장에서 우리는 벼 DXS 아이소폼(OsDXSs)의 구조, 조직 특이성, 조절 역할에 따른 기능적 차이를 밝히는 것을 목표로 하였습니다. 벼(Oryza sativa)에는 세 가지 DXS(OsDXS1, OsDXS2, OsDXS3)가 존재하며, 각각 고유한 계통으로 분류됩니다. OsDXS1과 OsDXS2는 서로 밀접한 관계를 가지지만, OsDXS3는 상대적으로 더 거리가 먼 관계에 있습니다. 구조 기반의 단백질 분류 결과, OsDXS1과 OsDXS2는 진화 계통에서 초기 단계에 분기된 것으로 나타났고, OsDXS3는 다른 집단(outgroup)으로 분류되었습니다. 이와 일관되게, 라이코펜을 생성하는 대장균에서 수행한 효소 활성 분석 결과, OsDXS1과 OsDXS2는 높은 활성을 보였으나, OsDXS3는 거의 활성을 나타내지 않았습니다. 벼 원형질체를 이용한 소기관 내 위치 분석에서는 세 단백질 모두 엽록체에 위치했지만, 각기 다른 표적화 패턴이 확인되었습니다. OsDXS1과 OsDXS2는 플라스토글로불(PGs)과 관련되었으며, OsDXS3는 스트로마에 위치했습니다. 프로모터 분석을 통해서도 뚜렷한 발현 패턴 차이가 관찰되었습니다. OsDXS1은 광합성 조직, 꽃, 발아 중인 유묘에서 발현되었으나 종자에서는 발현되지 않았고, OsDXS2는 주로 잎맥과 종자의 배반(scutella)에서 발현되었으며, OsDXS3는 생식 시기의 잎과 종자 배아(embryo)에서 발현되었습니다. 기능 연구에서, OsDXS1, OsDXS2, OsDXS3를 개별로, 또는 베타카로틴 생성 재조합 유전자(synthetic stPSY-2A-stCrtI, stPAC)와 함께 과발현한 결과, 광합성 기관에서는 유의미한 차이가 나타나지 않았으나, OsDXS1-stPAC과 OsDXS2-stPAC에서는 종자의 카로티노이드 함량이 증가했습니다. 기능상실 연구에서는 뚜렷한 표현형 차이가 나타났는데, osdxs1 돌연변이는 백화(albino) 잎을, osdxs2는 검게 변한 종자를, osdxs3는 정상적인 표현형을 보였습니다. osdxs1의 치사적 표현형은 OsDXS1의 과발현으로만 완전히 회복되어, 벼에서 세 DXS 아이소폼 간에 기능적 중복이 없음을 시사합니다. 마지막으로 단백질 간 상호작용 분석에서 세 OsDXS가 동형(homo-) 및 이형 이합체(heterodimer)를 형성할 수 있으며, 이형 이합체 간에 다양한 효소 활성이 나타났습니다. 종합적으로, 본 연구는 벼 DXS 패밀리 내의 기능적 차이와 상호작용을 명확히 밝혔습니다.
제2장에서는 plastid 내에서 벼 PSY2(OsPSY2)의 PG 표적화 기작을 규명하고자 했습니다. 이를 위해, OsPSY2의 세 개의 소수성 영역(hydrophobic region, HR)인 HR1(1–45번째 아미노산), HR2(46–80번째 아미노산), HR3(229–247번째 아미노산)의 영향력을 분석하였습니다. 그 결과, 엽록체 진입에 중요한 서열은 HR1 내에 위치(31–45번째 아미노산)하며, 진입 후 스트로마에서의 절단은 HR2의 특정 알라닌 잔기(64번째 아미노산)에서 발생하여 N-말단의 64개의 아미노산 영역이 수송 펩타이드(transit peptide, Tp)로 기능함을 확인했습니다. HR2는 엽록체 내 PG와 스트로마에서 동시(synchronous) 또는 비동시적(asynchronous) 적중 양상을 보여 약한 PG 표적화 신호를 나타냈습니다. 반면, HR3는 강한 PG 표적화 기능을 보여주며, 단백질의 비축적(non-accumulation), 응집(aggregation) 또는 오접힘(misfolding)과 같은 문제를 방지하기 위한 위치적 특이성을 가집니다. 본 연구에서 우리는 OsPSY2의 세 개의 HR 내에 하나의 Tp와 두 개의 막 관통(transmembrane) 영역을 규명하였으며, OsPSY2가 자발적 전이 경로(spontaneous pathway)를 통하여 PG의 단일막에 내재된 구조로 적중함을 제안하였습니다. 결론적으로, OsPSY2의 PG 표적화 메커니즘을 밝혀냈으며, plastid 내 특정 소기관으로의 표적화 전략에 대한 통찰을 제공하였습니다.
본 연구는 벼에서 터펜 대사에 관여하는 subfamily 내 구별된 조절과 해당 대사 장소로의 표적화 기작을 밝혀내어, 식물 터펜 대사에 대한 중요한 통할과 작물생명공학을 위한 잠재적 접근 방안을 제공합니다.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER Ⅰ. Molecular Characteristics of Three Rice DXP Synthases: Structure, Tissue-specificity, and Regulatory Properties 1
• Ⅰ-1. Abstract 2
• Ⅰ-2. Introduction 4
• Ⅰ-3. Materials and Methods 7
• Ⅰ-4. Results 16
• Ⅰ-5. Discussion 25
• Ⅰ-6. References 29
• Ⅰ-7. Tables and Figures 36
• CHAPTER Ⅱ. Stepwise Protein Targeting into Plastoglobules Are Facilitated by Three Hydrophobic Regions of Rice Phytoene Synthase 2 69
• Ⅱ-1. Abstract 70
• Ⅱ-2. Introduction 71
• Ⅱ-3. Materials and Methods 75
• Ⅱ-4. Results 79
• Ⅱ-5. Discussion 86
• Ⅱ-6. References 89
• Ⅱ-7. Tables and Figures 93
• 국문초록 109
• ACKNOWLEDGMENT 113