Attenuation of UVB-Induced photodamage by γ-Mangostin through the downregulation of MAPK/AP-1/MMP-1 and activation of autophagy in HaCaT cells and a UVB-induced photoaged mouse model : HaCaT 세포와 UVB 유도 광노화 마우스 모델에서 감마-망고스틴에 의한 MAPK/AP-1/MMP-1 하향 조절과 오토파지 활성화를 통한 광손상 완화

국문 초록 (Abstract)

전세계적으로 인구의 고령화가 진행됨에 따라, 노인 인구가 기하급수적으로 증가하고 있으며 많은 사람들의 초점이 단순히 오래 사는 것이 아닌 건강하고 아름다운 상태를 유지하며 오래 사는 것에 맞추어지고 있다. 피부 노화는 가장 가시적인 노화의 척도로, 많은 사람들이 피부의 아름다움과 건강을 유지하고자 하는 열망을 가지고 있다. 피부 노화에 가장 치명적인 자외선은 세포에 과도한 활성산소를 생성하고 다양한 신호전달경로에 변화를 가져와 collagen, elastin, hyaluronic acid 등의 피부 구성 요소를 파괴한다. 이는 결과적으로 피부에 주름, 홍반 등을 유발하고 피부를 거칠게 하며, 다양한 피부 질환의 원인이 된다. 오토파지는 과도하게 축적된 세포 내 물질이나 손상된 단백질 등을 분해하는 메커니즘으로, 자외선에 의한 DNA 손상이나 기능을 잃은 기관, 단백질들이 오토파지에 의해 회복되고 분해될 수 있다고 알려져 있다. 따라서 우리는 오토파지 활성화를 통한 피부노화 억제물질의 가능성을 찾고자 분자도킹을 활용하였다. 그 결과, Nypa fruticans Wurmb.에 포함된 8가지 잔톤계열의 물질 중 mTOR 단백질의 결합부위에 가장 뛰어난 결합에너지를 나타낸 물질로 감마-망고스틴이 선정되었다. 감마-망고스틴은 경쟁적 저해제로서 elastase를 효과적으로 억제하였고 (IC50 : 56.17 ± 6.16 μM), 이는 양성대조군인 EGCG의 효과 (IC50 : 309.58 ± 7.66 μM) 보다 약 5.5배 강력하게 작용했다. 자외선을 처리하지 않은 인간유래각질세포에서 감마-망고스틴은 10 μM까지 세포독성을 나타내지 않았다. 자외선을 처리한 세포에서는 2.5 μM의 농도까지 자외선에 의한 세포 사멸을 보호하는 효과를 나타내었고 5 μM의 농도에서 약한 독성을 나타내었다. 하지만 1-5 μM의 농도에서 ROS 생성을 효과적으로 억제하였다. 감마-망고스틴은 SOD-1/GPX-1/CAT과 같은 항산화 효소의 활성화와 TRXR1/TXNIP의 조절을 통해 세포를 1차적으로 보호하는 효과를 나타내었다. 또한, 감마-망고스틴은 Nrf2/HO-1 경로의 활성화를 통해 자외선에 의해 유도되는 ROS 생성을 차단하였다. 감마-망고스틴은 MAPK/AP-1/MMP-1 경로의 활성화를 차단하고 TIMP-1과 COL1A1의 발현을 상향 조절하여 피부 조직 구성 단백질을 효과적으로 보호하였다. 감마-망고스틴은 또한 오토파고좀 형성에 관여하는 Beclin1, Atg5, LC3 발현을 상향조절하고 p62의 발현을 억제하여 효과적인 오토파지 유도제로 작용하였다. 또한 mTOR를 효과적으로 억제함으로써 오토파지 활성화 효과가 mTOR에 의존적인 방식으로 진행됨을 확인하였다. 자외선 유도 광노화 마우스모델에서 감마-망고스틴의 처리는 피부 노화 및 손상을 효과적으로 억제하였다. 감마-망고스틴 처리 집단은 등 피부의 주름 형성, 피부 두께 증가, 콜라겐 섬유 감소 를 억제하는 효과를 보였다. 또한 등 조직을 채취하여 피부의 분해 및 구조 단백질의 발현을 살펴보았을 때 피부 장벽 기능에 관여하는 단백질의 발현을 조절함으로써 경피수분 손실량의 증가를 막았다. 또한 in vitro 실험과 마찬가지로 마우스 모델에서도 감마-망고스틴의 처리가 MAPK/AP-1/MMP-1 신호전달 경로의 하향조절과 오토파지의 활성화를 유도하는 것을 통해 효과적으로 피부를 보호함을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과로 미루어 볼 때, 감마-망고스틴이 자외선에 의한 피부 손상을 완화할 수 있는 효과적인 물질로서 기능성 식품이나 기능성 화장품의 소재로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and methods 5
• 2.1. Chemicals and reagents 5
• 2.2. Molecular docking 6
• 2.2.1. Preparation of protein and ligand structure 6
• 2.2.2. Molecular docking simulation 6
• 2.3. Elastase inhibition assay 8
• 2.4. Enzyme kinetic assay 9
• 2.5. Cell culture conditions and cell viability assay 10
• 2.6. Measurement of cellular ROS generation 11
• 2.7. Western blotting 12
• 2.8. UVB-induced photoaged mouse model 13
• 2.9. Mouse dorsal skin analysis 15
• 2.10. Histological analysis 15
• 2.11. Statistical analysis 16
• 3. Results and discussion 17
• 3.1. Molecular docking results of various xanthones found in Nypa fruticans Wurmb. 17
• 3.2. Effect of γM on elastase inhibitory activity and its kinetic analysis 21
• 3.3. Cell viability of different concentrations of γM in HaCaT cells 23
• 3.4. ROS scavenging activity of γM in UVB-exposed HaCaT cells 25
• 3.5. Effect of γM on the expression of antioxidant enzymes in UVB-exposed HaCaT cells 26
• 3.6. ROS scavenging activity of γM through the activation of Nrf2/HO-1 signaling in UVB- exposed HaCaT cells 28
• 3.7. Effect of γM against skin degradation and skin aging in UVB-exposed HaCaT cells 30
• 3.8. Effect of γM against skin degradation and oxidative stress through the inhibition of MAPKs/AP-1 32
• 3.9. Effect of γM against skin degradation through autophagy induction 36
• 3.10. Effect of γM against the photodamage in UVB-exposed mouse dorsal skin 39
• 3.11. Effect of γM on skin barrier function in UVB-exposed mouse dorsal skin 41
• 3.12. Effect of γM against skin degradation in UVB-exposed mouse dorsal skin 43
• 3.13. Effect of γM on the phosphorylation of MAPK/AP-1 in UVB-exposed mouse dorsal skin 45
• 3.14. Effect of γM on autophagy induction in UVB-exposed mouse dorsal skin 47
• 4. Conclusion 49
• References 52
• Abstract in Korean 56