아데노이드 및 장내 마이크로바이옴이 만성 삼출성 중이염에 미치는 영향 = The influence of microbiome in adenoid and gut on chronic otitis media with effusion

국문 초록 (Abstract)

삼출성 중이염(Otitis Media with Effusion, OME)은 심각한 염증 징후는 없지만, 중이에 삼출액이 존재하는 질환이다. OME는 대부분 자연적으로 치료되지만, 몇몇의 경우에는 3 개월 이상 지속되는 chronic otitis media with effusion (COME)이 나타나며, 이것은 아동 발달에 부정적인 영향을 미친다. 아데노이드는 비인두에 위치하며, 상피세포 및 다양한 면역 세포로 이루어진 림프조직이다. 이때 아데노이드 내의 마이크로바이옴 변화는 유스타키오관의 기능장애를 일으킬 수 있기 때문에 OME에 영향을 미칠 수 있다. 기존 연구들은 아데노이드 마이크로바이옴이 OME에 미치는 영향을 규명하기 위해 배양 기반 실험 혹은 16s RNA amplicon sequencing을 활용한 연구가 진행되었다. 하지만 종 수준에서 비교와 박테리아의 기능에 대한 정보를 제공하는 연구는 아직 부족하다. 그러므로 본 연구에서는 whole metagenome shotgun sequencing과 종 수준 및 기능 분석을 통해 아데노이드와 장에 존재하는 마이크로바이옴이 COME와 어떤 연관성을 가지는지 확인해 보았다.
본 연구에서는 정상인 아동과 COME에 걸린 아동으로부터 아데노이드 swab과 분변 시료를 수집했다. 전체 시료들에 대한 whole metagenome shotgun sequencing 결과로 얻은 read들은 품질 필터링과 숙주 유래 read 제거를 진행한 후 HuManN3 파이프라인을 사용하여 분류학적, 기능적 데이터를 얻었다. 수집된 시료들의 박테리아 양을 정량하기 위해 real time-PCR을 진행했다. 아데노이드와 장에 존재하는 박테리아 군집의 다양성 및 구성은 유의미한 차이를 보였다. 아데노이드 박테리아 군집은 정상군과 장액성 (Serous) 및 점액성 (Mucoid) 질환군에서 서로 다른 것을 확인했다. 또한 정상군의 아데노이드 박테리아 군집은 연령 구간에 따른 변화를 보였지만, 질환군 그룹들에서는 이러한 변화가 교란되었다. 연령 그룹 내 분석에서, 2-5세 그룹보다는 6-12세 그룹의 아데노이드 마이크로바이옴의 변화가 COME와 더 많은 연관성을 가졌다. 그리고 장내 마이크로바이옴의 경우 아데노이드 마이크로바이옴과는 달리 COME와의 연관성을 찾을 수 없었다. 6-12세 그룹의 아데노이드 마이크로바이옴의 경우, 아세테이트의 생합성 감소가 COME와 연관되어 있으며, 이러한 기능에 S. parasanguinis 가 중요한 종이라는 것을 확인했다. 또한 S.
parasanguinis의 주변 종들은 아세테이트를 이용하여 병원균과의 경쟁관계에서 공생균이 우위를 점할 수 있도록 해주는 대사산물인 acetyl phosphate (AcP) 생합성 기능을 가지고 있었다. 또한 NAD+ 생합성이 COME 병원균인 S. pneumoniae의 억제와 연관성이 있는 것을 확인했다. 하지만 점액성 질환군에서 S. pneumoniae 가 억제되지 못한다면, 이 종이 생산하는 indole이 COME에 만성이라는 특징에 기여할 수 있다는 것을 확인했다. 이러한 결과는 아데노이드 마이크로바이옴과 COME 간의 연관성에 대한 이해를 넓히고 치료 전략을 개발하는 데 활용될 수 있습니다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Otitis media with effusion (OME) is defined as the presence of middle ear effusion without signs of severe inflammation in middle ear. While OME spontaneously resolves, in some cases it can persist for over 3 months, resulting in chronic otitis media with effusion (COME). The COME can negatively impact child development. The adenoid, located in the nasopharynx, is a lymphoid tissue composed of epithelial cells and various immune cells. Alteration of adenoid
microbiome is one of risk factors about OME, as these alteration can cause dysfunction of eustachian tube. Previous studies have utilized culture-based experiments or 16s rRNA gene amplicon sequencing to elucidate influence of
adenoid microbiome on OME. However, there is still a lack of study providing information on bacterial function and composition at species level. Therefore, we analyzed microbiome in adenoid and gut to determine the influence on chronic otitis media with effusion (COME) using whole metagenome shotgun sequencing. Adenoid swab and feces were collected from childhood with COME or healthy children. Whole metagenome shotgun sequencing was performed by
Illumina NovaSeq platform. The reads obtained from sequencing were used toobtain taxonomy and functional data using HuManN3 pipeline after quality filtering and host-derived read removal. Bacterial load was quantified using quantitative real-time PCR. The microbiota between adenoid and gut significantly differed. Adenoid microbiota differed between control and serous, mucoid group. While alteration was observed in the adenoid microbiota of the control group
according to age group, these alteration was disrupted in the disease groups. In analysis within each age group, we found that alteration of adenoid microbiome was more strongly associated with COME in 6-12 years old group than 2-5 years
old group. However, no association with COME could be found for the gut microbiome, unlike the adenoid microbiome. In adenoid microbiome in 6-12 years old group, reduced acetate biosynthesis was associated with mucoid COME, confirming that S. parasanguinis is an important species for these function. In addition, the neighboring species about S. parasanguinis produced acetyl phosphate (AcP), a metabolite that gives the commensal bacteria an advantage in competition with the pathogen, utilizing acetate. The NAD+ produced by several commensal bacteria inhibited S. pneumoniae. However, when these species was not controlled in mucoid COME, the indole produced by this species
could contribute to the chronic property of COME. These results expands our understanding of the influence of the adenoid microbiome on the pathogenesis of COME and may be utilized to develop therapeutic strategies.
Keywords: Chronic otitis media with effusion, adenoid microbiome, middle ear effusion type, pathogen inhibition

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 삼출성 중이염 (Otitis media with effusion)의 정의 및 유형 1
• 2. OME와 유스타키오 관의 기능장애 간의 연관성 2
• 3. Host와 마이크로바이옴의 상호작용 3
• 4. OME에서 아데노이드 및 중이 마이크로바이옴의 특징 4
• Ⅱ. 재료 및 방법 6
• 1. 윤리적 승인 6
• 2. 연구 피실험자 모집 및 시료 수집 6
• 3. DNA 추출 kit를 이용한 metagenomic DNA 추출 7
• 4. Whole metagenome shotgun sequencing 수행 8
• 5. 박테리아 수 정량을 위한 quantitative real-time(qRT) PCR 9
• 6. 마이크로바이옴 분석 10
• A. Decontamination 과정 및 데이터 전처리 과정 10
• B. 임상 정보 분석 11
• C. 마이크로바이옴 다양성 분석 11
• D. Envfit 분석 12
• E. MaAsLin 분석 12
• F. Random forest regression model 13
• G. 네트워크 분석 14
• H. 기능적 특징 분석 14
• Ⅲ. 결과 16
• 1. 아데노이드와 장내 박테리아 군집 간 비교 분석 16
• 2. 아데노이드와 장내 박테리아 군집에서 정상군과 질환군 간의 비교 21
• 3. 연령에 따른 박테리아 군집 발달과 연령 그룹 내 박테리아 군집 비교 25
• 4. 연령 그룹 내 아데노이드 마이크로바이옴의 기능 분석 29
• 5. 장내 마이크로바이옴에 대한 기능 분석 34
• 6. 아데노이드 마이크로바이옴의 정상군 및 질환군의 군집 네트워크 분석 36
• 7. 특정 Gene family에 대한 기여 박테리아 데이터 분석 48
• Ⅳ. 고찰 42
• Ⅴ. 참고문헌 49
• 영문 초록 (Abstract in English) 55