Development of a tumor metastasis chip based on microfluidic technology utilizing micro - vascular in hydrogel = 하이드로겔내 미세혈관을 활용한 미세유체 기술 기반 종양 전이 칩 개발

국문 초록 (Abstract)

암은 사망률이 높은 질병입니다. 암의 사망률이 높은 이유 중 하나는 사람의 혈관에서 신생 혈관을 끌어들여 성장한 암이 혈관을 통해 이동하여 다른 장기의 전이를 일으키기 때문에 사람의 생존율이 매우 떨어지게 됩니다. 생존율을 올리기 위해선 많은 억제제와 항암제의 시험이 많이 필요합니다. 하지만 시험 하기 위해선 먼저 시험 할 수 있는 모델을 확립해야 합니다. 모델을 확립하기 위하여 이와 같은 연구를 진행하였습니다. 세포 외 기질에 대해 평가하기 위하여 젤라틴 바이오 잉크와 실크 바이오 잉크를 각각 평가하였습니다. 그리고 평가 한 두 잉크를 적절한 비율로 섞어서 3D 프린팅을 통하여 다양한 구조를 만들 수 있음을 확인하였습니다. 또한 이 잉크가 세포 배양에 적합한 잉크임을 세포 생존 시험을 통하여 확인하고, 마지막으로 구조 내에서 혈관 세포가 혈관 네트워크를 잘 이루는 것을 확인하였고, 이는 혈관을 수 있는 가능성을 확인하였습니다. 두 번째로 암세포의 신생 혈관을 확인하는 것에 중점을 두었습니다. 순환 배양을 통하여 혈관을 모방한 모델을 설계하고, 장기 배양에 적합한 모델임을 확인하였습니다. 그리고 혈관과 암세포 사이를 면역형광염색으로 혈관 세포가 암세포 쪽으로 성장하는 모습을 확인하였습니다. 이는 암세포가 신생 혈관을 유도한다는 점을 확인할 수 있었습니다. 암세포의 신생 혈관으로의 이동을 확인하였습니다. 혈관 세포와 암세포 특이적인 인자들을 같이 면역형광염색 하여 혈관 세포 내에 존재하는 암세포에 관해서 확인하였습니다. 신생 혈관이 암세포 쪽으로 완전하게 자라나게 되었을 때, 암세포가 자라난 신생 혈관을 통하여 이동할 수 있는 것을 확인할 수 있었습니다. 결론적으로 3D 프린팅 할 바이오 잉크에 대하여 잉크 내에서 세포 생존을 평가하고, 구조 내에서 혈관 세포가 혈관 네트워크가 잘 이루어지는 것을 확인하였고, 이는 통해 혈관을 구성하는데 있어 더욱 적합한 잉크에 대하여 평가할 수 있었습니다. 평가된 바이오 잉크로 3D 프린팅을 진행하여, 순환 배양을 하였고, 혈관 세포가 암세포 쪽으로 자라나는 것을 확인하였습니다. 마지막으로 혈관 세포가 어느 정도 암세포 쪽으로 자라났을 때 암세포가 신생 혈관 내에 존재하는 것을 확인하였고, 이는 즉 암세포의 이동이라는 점을 확인할 수 있었습니다. 위 논문은 3D 프린팅을 통한 신생 혈관, 암 전이에 관해서 확인할 수 있는 모델임을 바이오 잉크에 대한 평가, 혈관 네트워크의 형성, 순환 배양, 면역형광염색을 통하여 확인하였습니다. 이를 통해 혈관 세포와 암세포 사이의 상호작용에 관해 확인할 수 있었고, 다음에 혈관 채널의 배양액을 모아서 암세포에서 나오는 신생혈관 인자들에 대해서 평가할 수 있을 것입니다, 또한 항암제, 억제제를 순환 배양 채널에 투입하여 암세포의 사멸을 확인할 수 있을 것으로 생각됩니다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cancer is the ability of cancer cells that grow by attracting newly formed blood vessels in the human vascular system to travel through the bloodstream and cause metastasis to other organs, greatly reducing the patient's survival rate. Extensive testing of inhibitors and anticancer drugs is important to improve survival. However, prior research is needed to establish a model for testing. In this study, we conducted a study to build a model by evaluating gelatin bioink and silk bioink to evaluate extracellular matrix. The evaluated bioinks were mixed in appropriate ratios to confirm their ability to create various structures through 3D printing. Additionally, we confirmed the suitability of these inks for cell culture through cell survival tests and observed the successful formation of vascular networks by vascular cells within the structures, indicating their potential for vascularization. The second focus of our study was to determine angiogenesis in cancer cells. A model mimicking blood vessels was designed through perfusion culture and its suitability for organ culture was confirmed. Using immunofluorescence staining, we observed vascular cells growing toward cancer cells, indicating that cancer cells induce the formation of new blood vessels. We also observed cancer cells moving toward newly formed blood vessels. Immunofluorescence staining for specific factors between vascular cells and cancer cells revealed the presence of cancer cells within vascular cells. It was confirmed that when new blood vessels fully grow toward cancer cells, cancer cells can move through the newly formed blood vessels. In conclusion, we evaluated bioinks for 3D printing, assessed cell survival within the ink, confirmed vascular network formation within the structures, and assessed interactions between vascular cells and cancer cells through perfusion culture and immunofluorescence staining. This model provides insight into angiogenesis and cancer metastasis through 3D printing, paving the way for future evaluation of factors released by cancer cells in the culture medium. Additionally, we anticipate the potential to test anti-cancer drugs and inhibitors in perfusion culture channels to confirm cancer cell death.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. MATERIALS AND METHODS 4
• 2.1 Development of rotary 3D printer & 3D modelling & circulation 4
• 2.1.1 Development of rotary 3D printer 4
• 2.1.2 3D Modelling 4
• 2.1.3 Circulation equipment composition and sterilization 5
• 2.2 Fabrication of bio-ink 5
• 2.2.1 Methacrylation of gelatin 5
• 2.2.2 Extraction of silk fibroin 6
• 2.2.3 Methacrylation of silk fibroin 6
• 2.2.4 Fabrication of photo-curable bioink 7
• 2.3 Cell culture & spheroid formation 7
• 2.3.1 Cell culture 7
• 2.3.2 MDA-MB-231 spheroid formation 8
• 2.4 Mechanical and rheological properties of GelGMA, SGMA, G + S 9
• 2.4.1 GelGMA, SGMA, GelMA 1H-NMR, FT-IR 9
• 2.4.2 GelGMA, SGMA, G + S Mechanical properties & Rheoloigy 10
• 2.4.3 GelGMA, SGMA, G + S Swelling properties and degradation 11
• 2.5 Cell proliferation & Biocompatibility 11
• 2.5.1 CCK-8 Assay in GelGMA, SGMA, G + S bio-ink 11
• 2.5.2 L&D Assay in GelGMA, SGMA, G + S bio-ink 12
• 2.6 Hydrogel Printability Test, Circulation Test 13
• 2.7 Experiment on differences in vascularization depending on bioink.13
• 2.8 Confirmation of invasion through cell labeling 14
• 2.9 Whole hydrogel immunofluorescence staining 15
• 2.10 Statistical analysis 15
• 3. RESULTS 16
• 3.1 Manufacturing process of SGMA bio-ink and GelGMA bio-ink and overall process of 3D printing circular culture model 16
• 3.2 Print a variety of models using a rotary 3D printer 18
• 3.3 Spheronization of MDA-MB-231 cells 20
• 3.4 Live & dead assay depending on long printing time 22
• 3.5 Hydrogel printability and cyclic function test 24
• 3.6 Characterization of SGMA, GelGMA 26
• 3.7 Mechanical properties of hydrogel 28
• 3.8 Rheological properties of GelGMA, SGMA, G + S hydrogel 30
• 3.9 Cell viability and cell proliferation tests of SGMA, GelGMA and G + S hydrogels. 32
• 3.10 Cell migration and wound healing assays of GelGMA, G + S, and SGMA hydrogels 34
• 3.11 Vascularized formation of HUVEC cells 36
• 3.12 MDA-MB-231 cancer cells and HUVEC cell interaction and cell migration in 3D hydrogel HUVEC 38
• 3.13 Vascular junctions in channels in a 3D hydrogel circulating culture model 40
• 3.14 Vascular formation between cancer spheroids and vasculature using Immunofluorescence Staining 42
• 4. DISCUSSION 44
• 5. CONCULUSIONS 46
• REFERENCES 48