Application of alpha-synuclein aggregation in real-time quaking-induced conversion as a biomarker for Parkinson's disease = 파킨슨병에 대한 바이오마커로서 알파시누클레인 응집을 이용한 RT-QuIC 검사법 개발

국문 초록 (Abstract)

파킨슨병은 신경계 퇴행성 질환으로 임상 증상발생 시기보다 수년씩 선행하여 알파시누클레인 응집 병리가 발생한다. 프리온병의 진단법으로 개발된 실시간 진동 유도 변환(RT-QuIC)은 단백질 (알파시누클레인) 응집을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단 방법에도 응용되었다. RT-QuIC 검사는 환자의 생체시료 내에 존재하는 다량체의 병적인 알파시누클레인이 씨앗으로 작용하여, 재조합 정상 알파시누클레인과 함께 섞이면 정상단백질도 병적인 형태의 섬유체로 응집되는 원리를 이용한 것이다. 파킨슨병의 초기부터 파킨슨병 환자의 후각 신경에 알파시누클레인 응집 병리가 존재한다는 것은 후각 점막이 잠재적으로 RT-QuIC 분석의 씨앗 역할을 할 수 있음을 시사한다. 기존연구에서는 주로 뇌척수액을 이용하였으나 침습적인 채취의 문제가 있어서, 본 연구에서는 채취가 간편한 후각 점막을 사용하여 RT-QuIC 검사의 결과를 분석하였다. 본 연구에서는 재조합 알파시누클레인 단백을 만들고, 뇌척수액을 사용하여 RT-QuIC 분석법의 정확도를 검증하였다. 그런 다음 파킨슨병 환자 40 명을 대상으로 후각점막을 이용한 RTQuIC 을 평가하여 60%의 민감도를 확인하였다. 후각 기능 검사 결과와 비교하였을때, 후각점막 RT-QuIC 결과가 양성인 파킨슨병 환자는 음성 결과를 보인 환자보다 후각 식별 점수가 현저히 낮은 것으로 나타났다. 또한, 무후각증 환자의 80%가 후각점막 RT-QuIC 분석에서 양성인 반면 후각이 정상인 파킨슨병 환자의 50%만이 양성이어서 후각 기능이 악화됨에 따라 후각점막 RT-QuIC 검사의 민감도가 증가할 수 있음을 나타내었다. 마지막으로, RT-QuIC 검사를 위해, 채취가 간편한 시료인 혈액을 이용하여, 신경 엑소좀 추출을 프로코콜화 하였으며, 이를 이용하여 RT-QuIC 분석을 시도할 예정이다. 본 연구를 통해 파킨슨병의 생체시료로서 비교적 침습도가 적은 시료들로 RT-QuIC 검사 방법이 파킨슨병의
바이오마커로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
키워드: RT-QuIC, 알파시누클레인, 후각점막, 파킨슨병

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

One hallmark of Parkinson's disease (PD) is the presence of α-synuclein aggregation, which happens years earlier than the clinical symptoms. The ability of aggregated α-synuclein to propagate pathology in a prion-like manner has been harnessed in the development of a diagnostic method known as real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC). In RT-QuIC, aggregated α-synuclein from body fluids converts recombinant monomeric α-synuclein into misfolded form. The presence of α-synuclein aggregation in olfactory neurons suggests that the olfactory mucosa (OM) could potentially serve as a seeding source for the RT-QuIC assay. In this study, we established an RT-QuIC assay using in-house recombinant monomeric α-synuclein. We validated the assay with cerebrospinal fluid (CSF), demonstrating its ability to distinguish patients with synucleinopathy from controls. Then, we assessed OM RT-QuIC in 40 PD patients, achieving a sensitivity of 60%. When integrated with the olfactory function test, PD patients with positive OM RT-QuIC results exhibited a significantly lower discrimination score than those with negative results. Furthermore, 80% of anosmic PD patients were positive with OM RT-QuIC assay, while only 50% of normosmic PD patients were positive, indicating that OM RT-QuIC sensitivity may increase with the deterioration of olfactory function. Finally, the successful extraction of blood-derived neuronal exosome in this process opens the door for its evaluation as a novel source for the RT-QuIC assay.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• II. Methodology 4
• 1. Chemicals and instruments 4
• 2. Methods 4
• 2.1. Expression of recombinantn α-synuclein in E. coli BL21 (DE3) 4
• 2.2. Human α-synuclein recombinant protein purification 4
• a. Manual his-tag column purificatoin 6
• b. AKTA his-tag column purification 6
• 2.3. SDS-PAGE analyses 7
• 2.4. Human sample preparations and ethical statement 7
• 2.5. Neuronal exosome isolation from serum 8
• 2.6. Immunoblotting 9
• 2.7. α-synuclein RT-QuIC assay 10
• 2.8. Statistical analysis 10
• III. Results 12
• 1. Comparison between manual and AKTA human α-synuclein purification 12
• 2. Comfirmation of the recombinant α-synuclein seeding ability by CSF RT-QuIC 13
• 3. Relationship between OM RT-QuIC results and olfactory function in PD patients 16
• 4. Confirmation of neuronal exosome isolation by immunoblotting 20
• IV. Discussion 22
• V. Conclusion 24
• VI. Supplementary 25
• VII. References 29