고지방식이 비만 마우스에서 인슐린 저항성에 미치는 ascorbic acid의 효과 = Effects of ascorbic acid on insulin resistance in high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Effects of ascorbic acid on insulin resistance in
high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice.

Mijeong Lee

Department of Biology
The Graduate School of Mokwon University, Daejeon, Korea
Supervised by Professor Michung Yoon

Obesity caused by an imbalance between energy inflow and consumption has been an important risk factor for metabolic syndrome, including insulin resistance, type 2 diabetes, and cardiovascular disease. Obesity-linked insulin resistance develops through secretion of free fatty acids and adipokines from obese adipose tissue into the blood and adipose tissue inflammation. Since ascorbic acid (vitamin C), known as an antioxidant, has been suggested to inhibit adipocyte hypertrophy and diet­induced obesity, this study was attempted to investigate the effects of ascorbic acid on visceral obesity, adipocyte hypertrophy, insulin resistance and histological changes and function of pancreas in high­fat diet (HFD)­induced obese C57BL/6J mice, and elucidate its mechanism of actions.

1) When HFD­induced obese mice were treated with ascorbic acid for 9 weeks, body weight, visceral adipose
tissue weight and visceral adipocyte size were reduced without affecting food intake.
2) Ascorbic acid treatment reduced serum levels of total cholesterol, triglycerides, and the liver damage
marker alanine aminotransferase.
3) Ascorbic acid decreased fasting blood glucose and glucose levels during oral glucose tolerance test
(OGTT), alleviating impaired glucose tolerance.
4) Ascorbic acid improved impaired insulin resistance by lowering blood glucose concertrations during
intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT).
5) Ascorbic acid normalized pancreatic islet size and insulin-positive β cell area.
6) Ascorbic acid suppressed pancreatic steatosis by reducing pancreatic lipid accumulation.
7) Ascorbic acid inhibited pancreatic inflammation by lowering mast cells and CD68-positive areas in
pancreas.
8) Pancreatic collagen levels were not effectively regulated by ascorbic acid.
9) Ascorbic acid repressed viscreal adipose tissue inflammation, as evidenced by decreases in crown-like
structures and CD68-positive areas in visceral adipose tissue.
10) Ascorbic acid reduced mRNA levels of the inflammatory cytokine tumor necrosis factor α in visceral
adipose tissue.

In conclusion, these results show that ascorbic acid can not only effectively inhibit visceral obesity and adipocyte hypertrophy, but also mitigate hyperglycemia and insulin resistance without changes in food intake in HFD­induced obese C57BL/6J mice. Ascorbic acid inhibits pancreatic islet hypertrophy and insulin-secreting β cell area, and reduces pancreatic accumulation of lipids and inflammatory cells, thereby resulting in alleviated pancreatic steatosis and inflammation. It also decreases visceral adipose tissue inflammation and TNFα mRNA expression in adipose tissue. Therefore, it is likely that ascorbic acid may be a promising drug for alleviating obesity and insulin resistance by inhibiting adipocyte hypertrophy and adipose tissue inflammation.

국문 초록 (Abstract)

고지방식이 비만 마우스에서
인슐린 저항성에 미치는 ascorbic acid의 효과

이미정

목원대학교 대학원 생물학과 동물학전공
지도교수 윤미정

에너지 유입과 소비 간의 불균형으로 인해 발생한 비만은 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 심혈관질환 등을 포함하는 대사 증후군의 중요한 위험 인자이다. 인슐린 저항성은 비대해진 지방조직으로부터 혈액 내로 분비된 유리지방산과 아디포카인 및 지방조직의 염증으로 인해 발생하며, 이러한 염증은 비대한 지방세포에서 생성되는 사이토카인들과 관련이 있다. 항산화제로 알려져 있는 ascorbic acid (vitamin C)가 지방세포 비대 및 식이로 유발된 비만을 억제한다고 제안되어져 왔으므로 본연구에서는 고지방식이로 유도된 C57BL/6J 비만 마우스에서 내장 비만, 지방세포 비대, 인슐린 저항성 및 췌장의 조직학적 변화와 기능에 미치는 ascorbic acid의 영향을 조사하고, 지방조직 염증에 대한 ascorbic acid의 효과와 이러한 과정을 매개하는 기작을 규명하고자 하였다.

1) 9 주간의 고지방식이로 유도된 비만 마우스에 ascorbic acid를 처리하였을 때, 음식 섭취량에 영향을 미치지 않고도
체중, 내장 지방조직 무게와 내장 지방세포 크기를 감소시켰다.
2) Ascorbic acid 처리는 혈청 total cholesterol과 triglycerides, 간 손상 지표인 혈청 alanine aminotransferase 수준
을 감소시켰다.
3) Ascorbic acid에 의해 공복 혈당과 경구 포도당 부하 검사 (OGTT)의 혈당 농도가 감소함으로써 손상된 포도당 내성이
완화되었다.
4) Ascorbic acid는 복강내 인슐린내성검사 (IPITT)의 혈당 농도를 낮춤으로써 손상된 인슐린 저항성을 개선시켰다.
5) Ascorbic acid에 의해 췌장 랑게르한스섬의 크기와 insulin-positive β 세포 면적이 유의하게 감소하였다.
6) Ascorbic acid는 췌장의 지질 축적을 감소시켜 췌장 지방증을 억제하였다.
7) 췌장의 mast cell과 CD68-positive 면적이 ascorbic acid에 의해 유의하게 감소함으로써 췌장의 염증이 억제되었다.
8) 췌장의 콜라겐 수준은 ascorbic acid에 의해 효과적으로 조절되지 않았다.
9) Ascorbic acid는 내장지방 조직의 crown-like structure와 CD68-positive 면적을 유의하게 감소시킴으로써 지방조
직의 염증을 억제하였다.
10) Ascorbic acid에 의해 내장지방조직에서 염증성 사이토카인인 TNFα mRNA 발현이 감소되었다.

결론적으로, 이러한 결과들은 ascorbic acid가 고지방식이로 유도된 비만 C57BL/6J 마우스에서 음식 섭취량의 변화 없이, 내장 비만과 지방세포 비대를 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 고혈당증과 인슐린 저항성을 완화시킬 수 있음을 보여준다. Ascorbic acid는 췌장 랑게르한스섬의 비대와 인슐린을 분비하는 β 세포의 면적을 효과적으로 억제하며. 췌장 지질과 염증세포의 축적을 감소시켜 췌장의 지방증과 염증을 완화시켰다. 또한 내장지방 조직에서 염증을 감소시키고, 지방조직의 TNFα mRNA 발현을 감소시켰다. 따라서, ascorbic acid는 지방세포 비대와 지방조직 염증을 억제시켜 비만과 인슐린 저항성을 완화시키는 유망한 약물이 될 수 있을 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• 목차 ⅰ
• 표목차 ⅴ
• 그림목차 ⅵ
• 약어 (Abbreviation) ⅷ
• 국문요약 ⅹ
• I. 서론 1
• 1. 비만 1
• 1.1. 비만 1
• 1.2. 내장비만과 대사질환 2
• 1.3. 인슐린 저항성 3
• 2. 췌장 7
• 2.1. 췌장의 islet 7
• 2.2. 췌장의 지방증, 염증 및 섬유증 8
• 3. 지방조직 11
• 3.1. 지방세포의 비대 11
• 3.2. 지방조직의 염증 12
• 3.3. TNFα 15
• 4. Ascorbic acid 16
• 4.1. Ascorbic acid의 생합성 16
• 4.2. Ascorbic acid의 생리적 기능 19
• 4.3. Ascorbic acid와 비만 20
• 4.4. Ascorbic acid와 인슐린 저항성 22
• II. 실험 재료 및 방법 24
• 1. 실험재료 24
• 1.1. Chemicals 24
• 1.2. Animal and diets 24
• 2. 실험방법 27
• 2.1. 혈청 분석 27
• 2.2. oral glucose tolerance test 27
• 2.3. intraperitoneal insulin tolerance test 28
• 2.4. 조직의 형태학적 분석 28
• 1.1.1. Formalin 고정, 포매 및 박절 28
• 1.1.2. Hematoxylin & eosin 염색 29
• 1.1.3. Toluidine Blue 염색 29
• 1.1.4. Masson’s trichrome 염색 29
• 2.5. Immunohistochemistry 30
• 2.6. Target gene 발현분석 30
• 2.6.1. Total RNA 추출 30
• 2.6.2. cDNA 준비 31
• 2.6.3. Real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) 31
• 2.7. Statistics 32
• III. 실험 결과 33
• 1.1. 비만에서의 ascorbic acid의 작용 33
• 1.1.1. 몸무게와 지방조직무게 33
• 1.1.2. 지방세포의 morphology와 크기 37
• 1.1.3. 혈청 ALT, AST 및 지질 농도 37
• 1.2. 포도당 대사에 대한 ascorbic acid의 영향 40
• 1.2.1. 공복 혈당 40
• 1.2.2. 혈청 insulin 농도 40
• 1.2.3. QUICKI 40
• 1.2.4. HOMA-IR 42
• 1.2.5. oral glucose tolerance test 42
• 1.2.6. intraperitoneal insulin tolerance test 42
• 1.3. 췌장 islet의 morphology 및 Insulin-positive β세포에 대한 ascorbic acid의 영향 44
• 1.3.1. 췌장 islet의 morphology 44
• 1.3.2. Insulin-positive β세포 44
• 1.4. 췌장의 지방증, 염증 및 섬유증에 대한 ascorbic acid의 영향 47
• 1.4.1. 지방증 47
• 1.4.2. 염증 47
• 1) 췌장의 mast cells 47
• 2) CD68-positive macrophages 47
• 1.4.3. 섬유증 51
• 1.5. 내장지방조직의 염증 및 TNFα 발현에 대한 ascorbic acid의 영향 51
• 1.5.1. 염증 51
• 1) crown-like structures (CLS) 51
• 2) CD68-positive cells 51
• 1.5.2. TNFα 발현 55
• Ⅳ. 고찰 57
• Ⅴ. 참고문헌 65
• Abstract 84