Identification of genetic traits associated with inflammatory bowel disease using the UK Biobank database : For the 2,145 naive IBD patients of United Kingdom = UK Biobank 데이터베이스를 활용한 염증성 장질환과 연관된 유전 형식 식별

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: The IBD continuously increased across all over the industrialized societies. Estimated prevalence of IBD was from 3.7 million to more than 6.8 million between 1990 and 2017. Northern Europe especially United Kingdom and America show highest incidence of IBD. As a human body being a host of microbes, they attack our body causing an inflammation response and eventually lead to IBD. The cause of IBD is not yet known, but it is presumed to be caused by genetic, immune, and environmental factors. By previous study, pathologically causes of IBD are improper response of a inadequate mucosal immune system, impaired innate immune mechanisms of the epithelia layer, wrongly recognizing antigen, atypical antigen presenting cells, overreactive T cell and environmentally problems like food and stress. But still, it’s lack of explainable in biologically. Needs for studies to understand pathway by discover IBD associated gene function.
Genes associated study for IBD was previously studied from 1981. Many genes related to IBD reacting to several pathway such as barrier function, epithelial restitution, innate immune regulation, autophagy. Well known genes, IL23R and NOD2 regulates immune responses. CDH1, GNA12 and PTPN2 react to barrier integrity. CARD9 integrates signals from many innate immune receptors that recognize viral, bacterial, and fungal motifs. IL-23, IL-6 and IL-17 crucial role in Th17 cell proliferation.

Objective: The aim of this study is to find out associated gene with IBD by using UK BioBank with white population more than 2,000 patients. Also, categorize subgroups in IBD and compared each group gene function and evaluate lab information with candidate genetic loci genotype level.

Methods: In this study, using the UK Biobank genetic and clinical data from 500,000 subjects. Detailed medical data in Hospital Episode Statistical data about diagnosis, General Practice data for drug prescription and Lab data with 67 blood test and biochemistry test results. As a definition of IBD, using ICD code and number of counter visits. For a sensitivity analysis five drugs for treating IBD were used and operation for measuring severity of IBD. After patient selection used their whole exome sequencing data to discover candidate of genetic loci and genes associated with IBD.
Two kind of variant level test were performed. As a frequency level, Cochran Armitage test was used for additive and the other models (allelic, recessive, and dominant) were tested by Fisher’s exact test. In a genotype level used multiple logistic regression adjusted with sex and age. For a sensitivity group, the type of IBD-specific medication and severity were additionally adjusted. As a gene level test which aggregates variants in the same gene were scored by Gene Variant wise Burden test and tested by multiple logistic regression. All candidates were passing adjusted P value under 0.05.

Results: Study groups were diagnosed with ICD 9 and 10 version 2,145 IBD cases, 714 CD cases and 1,431 UC cases and 573 sensitivity IBD cases group. In total, 13 disease-associated loci (4.33ⅹ10^(−8) < P < 1.05ⅹ10^(−6)) were identified in a IBD group. IL23R(Interleukin 23 Receptor), rs11209026 (P = 4.33ⅹ10^(−8); OR 0.63) driving association in both variant-level and gene-level test(P = 1.16ⅹ10^(−8)). IL23R plays critical role in IBD related to protection against the development of CD and UC. CARD9(Caspase Recruitment Domain Family Member 9), rs4077515 (P = 3.54ⅹ10^(−7); OR 1.20) functions in the immune response against microorganisms. Another essential in pathology of IBD is GPX1 (Glutathione Peroxidase 1), rs1050450 (P = 2.46ⅹ10^(−5); OR 1.39). Roles in reduction of oxidase and peroxide. Lastly CFB (Complement Factor B), rs4151651 (P = 3.54ⅹ10^(−7); OR 1.20) is highly upregulated downstream of TLR3(Toll like receptor 3). TLR3 is one of the IBD pathogenesis role in innate immune system. Functional analysis was performed by DAVID tool. As a result, IBD function was clustered most highly in membrane and signal.
Additionally, linear regression was performed as a clinical analysis between IBD patients with CFB (rs4151651) carrier and other clinical traits. IBD patients with CFB carrier was linked with traits as apolipoprotein A, Aspartate aminotransferase, C-reactive protein, HDL cholesterol, potassium in urine, and alanine aminotransferase. CRP levels are used in serum marker of IBD to follow up patient’s inflammation react. In this analysis, when CFB variant has carrier induced highest level of CRP.

Conclusion: The availability of big scale of whole exome sequence data makes possible to insight the contribution of nonsynonymous variants affects into IBD. Moreover, biological function and checking discovered genetic loci’s genotype effect on IBD prognostic trait helps to understand effect size of carrier and non-carrier gene. Comparing each CD and UC associated genes’ function helps to understand functional difference of the two group.

국문 초록 (Abstract)

연구 배경: 산업화가 진행되면서 염증성 장질환은 전세계적으로 높은 발병률을 가지게 되었다. 살펴본 결과 1990년부터 2017년까지 질병 발생수는 370만명에서 680만명까지 증가였으며 전세계적으론 85.1%의 발병률이 증가하게 되었다. 일반적으로 가장 높은 발병률을 가진 국가는 북유럽의 영국과 북미로 보고되고 있다. 염증성 장질환은 외부 환경에 대해 민감한 숙주의 공생 미생물에 대한 공격에 대해 반응하고 유전적인 영향 등 지속적인 염증 반응으로 위장에서부터 장까지 염증이 발생하는 것으로 알려져 있다. 염증을 일으키는 원인은 여러 가지가 있다. 점막 면역 체계에 결함이 생겨 부적절하게 반응하는 것, 상피층의 선천적 면역 메커니즘의 교란, 잘못된 항원 인식, 비정형 항원 제시 세포, 과민성 T 세포 및 음식, 스트레스와 같은 환경 문제들로 인하여 염증 반응이 일어난다. 그러나 아직까지 염증성 장질환이 일어나는 생리학적인 분명한 원인은 알려지지 않은 것으로 추가적인 연구를 통해 질병의 중요성을 인식해야 된다는 점이 대두되고 있다.
염증성 장질환과 연관성 있는 유전자와 관련된 연구는 1981년에서부터 현재까지 꾸준히 연구되었다. 질병과 관련된 많은 유전자는 장벽 기능, 상피 회복, 선천적 면역 조절, 자가포식과 같은 여러 경로와 연관성이 있었다. 잘 알려진 유전자로는 IL23R과 NOD2로 면역 반응을 조절한다고 알려져 있다. 또한 장벽 무결설과 기능이 있는 CDH1, GNA12 및 PTPN2또한 연관성이 있다고 알려져 있다. CARD9는 바이러스, 박테리아 및 곰팡이 모티프를 인식하는 많은 선천성 면역 수용체의 신호를 통합한다. IL-23, IL-6 및 IL-17은 Th17 세포 증식에 중요한 역할을 한다. 면역 체계와 관련된 유전자들에 변이가 생길 경우 장 기능에 결함이 가 염증성 장질환과 같은 염증 반응을 지속적으로 일어나게 할 수 있다.
연구 목적: 본 연구의 목적은 2,000명 이상의 백인 환자를 대상으로 50만 이상의 환자 정보를 가지고 있는 UK Biobank 데이터 셋을 활용하여 염증성 장질환과 관련된 유전자를 찾고, 후보군들이 genotype heterozygosity에 따라 예후 영향에 서로 다른 영향을 미치는지 확인한다. 또한 염증성 장질환의 하위 그룹 크론병과 궤양성 대장염으로 나눠 각 그룹의 후보군과의 비교와 더불어 생리학적 차이들을 살펴보았다.
방법: 이 연구는 500,000명의 기증자의 유전체 데이터를 포함하는 UKBiobnak 데이터셋을 사용하였다. 피험자들의 병원 진단 기록과 더불어 약물 처방 기록, 일반 진료 데이터 및 67개의 혈액 검사와 생화학 검사 결과가 포함된 실험실 데이터들을 활용하였다. 임의적으로 지정한 실험군에 대한 정의는 ICD 9과 10 진단 코드로 정의 내려진 염증성 장질환과 외래방문 기록 1회 이상인 환자군을 뽑았으며, 크론병과 궤양성 대장염도 또 다른 그룹군으로 나누었다. 염증성 장질환에 대한 또 다른 조작적 정의로는 ICD 코드와 더불어 질환 치료제로 알려진 5가지 약물을 한 번 이상 사용한 사람을 순수한 염증성 장질환군으로 나누었다. 유전적 연관성을 살펴보기 위한 엑솜 시퀀싱 데이터를 사용하였고, 두 종류의 변이 수준의 테스트와 유전자 수준의 테스트를 진행하였다. 변이의 빈도 수준의 테스트는 Additive 모델의 경우 Cochran Armitage test를, 나머지 dominant, recessive, allelic 모델의 경우 Fisher’s exact test를 진행하였다. Genotype 순준의 변이 테스트는 multiple logistic regression 방법으로 나이와 성별을 조정하였다. 유전자 수준 테스트는 Gene level burden test 정의에 따라 변이별 GVB 점수를 매기고 같은 유전자에 속한 변이들을 하나의 유전자의 값으로 통합한 뒤 multiple logistic regression 테스트를 진행하였다. 모든 후보군들은 보정된 p value값이 0.05 미만인 유전자와 변이들을 추출하였다.
결과: 네 군의 연구 코호트는 진단코드로 정의 내려진 2,145명의 염증성 징질환 환자군과, 714명의 크론병, 1,431명의 궤양성 대장염 환자군 및 약제와 진단 코드로 정의된 573명의 염증성 장질환군으로 나눴다. 총 13개의 질병 관련 유전자 좌위(4.33ⅹ10^(-8) < P < 1.05ⅹ10^(-6))가 염증성 장질환과 연관성이 있는 것으로 확인되었으며 유전자 수준, 변이 수준에서 모든 테스트를 통과한 후보군은 IL23R, rs11209026(P = 4.33ⅹ10^(−8); OR 0.63)이었다. IL23R은 크론병과 궤양성 대정염의 발달에 대한 보호와 연결되어있으며, 염증성 장질환에서 중추적인 역할을 합니다. IL23은 STAT3, STAT4에 결합하여 단일화를 감소시키고 T 세포, NK 세포 및 대식세포를 매개한다. CARD9, rs4077515(P = 3.54ⅹ10^(−7); OR 1.20)는 미생물에 대한 면역 반응에서 기능합니다. GPX1, rs1050450 P = 2.46ⅹ10^(−5); OR 1.39)는 염증성 장질환의 병리학에서 또 다른 필수적인 역할을 하는 유전자로 알려져 있다. Oxidase와 peroxide의 환원 역할을 하여 염증 반응을 감소시키며, GPX1과 GPX2 유전자를 knockout시킨 쥐 실험체의 경우 회장과 결장에서 점막 염증의 발병률이 높아진다는 이전 연구가 있다. 그 외 4개의 크론병 관련 변이체가 발견되었다. LIG ,rs3730947(P = 2.92ⅹ10^(−6); OR 15.1)은 ATP 의존성 DNA리가아제의 구성원을 인코딩하고 DNA복제, 재조합 및 염기 절단 복구 과정에서 기능한다. DNA리가아제 I 결핍이 초래되는 경우 면역결핍이 일어나며 DNA 손상 인자에 대한 민감도를 증가시킨니다. 10개 궤양성 대장염과 관련이 있는 유전자가 후보군으로 발견되었고, 그중 6개가 변이를 가지는 경우 질환을 더 일으키는 방향을 가지는 loci들이 발견되었다. 궤양성 대장염GWAS를 통해 잘 알려진 2개의 관련 유전자는 BTNL2, rs28362677(P = 3.17ⅹ10^(-6); OR 1.30)와 HLA-DQB1, rs1049107 및 Pⅹ1049056(P = 1.52ⅹ10^=(-6) 및 6); ^(−6) OR 1.28)가 있었다. BTNL2는 HLA 영역에 위치하며 그 전령 RNA는 장에서 가장 많이 발현된다.
결론: 대량의 환자군으로부터 얻은 염기 서열 데이터를 활용하여 염증성 장질환과 연관성 있는 단백질 기능에 영향을 미치는 변이들을 후보 변이들을 추출하고, 후보변이들이 genotype에 따라 염증성 장질환의 예후 검사로 잘 알려진 C-reactive protein, 백혈수, 혈소판 혈액 수치들에 대해도 영향을 미치는지 확인하였다. 크론병의 후보군과 궤양성 대장염의 후보군들의 생리학적 기능을 비교함으로서 염증성 장질환의 생물학적 과정을 이해하였다.

목차 (Table of Contents)

• Contents
• Chapter 1. Introduction 1
• 1) Background 1
• 1. Incidence of IBD 1
• 2. Cause and pathogenesis of inflammatory bowel disease 2
• 3. Previous study of associated gene with IBD 4
• 4. Subgroup of IBD 5
• 2) Necessity of this study 7
• Chapter 2. Materials and methods 9
• 1) Data source 9
• 1. UK Biobank 9
• 2) Study design 11
• 3) Statistical analysis 14
• 1. Study group 14
• 2. Variant level test 14
• 3. Definition of Gene variant test and workflow 15
• Chapter 3. Results 17
• 1. Characteristics of study population 17
• 2. Candidates associated with IBD / CD / UC 20
• 3. Functional analysis of IBD and subgroup 25
• 4. Clinical analysis of IBD 28
• Chapter 4. Discussion 31
• Chapter 5. Conclusion 34
• References 35