삼투 스트레스 하에서 카멜리나CsRCI2E 단백질의 뿌리에서의 기능 분석 = Functional characterization of CsRCI2E under osmotic stress in root of Camelina sativa L.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Camelina (Camelina sativa L.) is a bio-energy crop having short life cycle about 90 days and contains high amount of unsaturated fatty acid in seeds. Rare Cold Inducible 2 (RCI2s) proteins are induced by environmental stresses such as salinity, drought, high temperature as well as low temperature. CsRCI2s have two transmembrane domains and are known to be localized in plasma membrane (PM). RCI2 proteins can divided into tail type (CsRCI2D, E, F, G) and no-tail type (CsRCI2A, B, C, H) depending on the presence of hydrophilic tail at the C-terminal. CsRCI2E is induced by salinity, cold and also drought stress. In this study, germination rate and root growth of CsRCI2E overexpressed plants were increased but H2O2 contents and MDA contents were reduced under mannitol and NaCl stress. Also, transcription level of ROS-scavenging related genes were increased in CsRCI2E overexpressed plants under mannitol and NaCl stress. To understand function of CsRCI2E in roots of Camelina, I conducted DAB staining with Camelina roots and showed different patterns under mannitol and NaCl stress, respectively. In addition to Camelina was damaged in root meristem under mannitol stress only. However, NaCl stressed Camelina roots were damaged in overall root including elongation and maturation zone. Also, gene level of CsRCI2E genes were induced in Camelina roots under NaCl stress only. However, CsRCI2E overexpressed plants were slightly damaged by oxidative stress than WT. In protein level, eYFP-CsRCI2E fusion protein was localized not only in plasma membrane but also moved to the form of vesicles. In addition, redistribution of CsRCI2E and CsPIP2;1 protein were observed using sucrose gradient analysis. It suggest that CsRCI2E might be related to endocytosis, and internalization of CsRCI2E is related to interaction with CsPIP2;1 in the root. Overall, these results indicated that CsRCI2E is a key role to enhance osmotic stress tolerance.

국문 초록 (Abstract)

카멜리나 (Camelina sativa L.)는 십자화과의 식물로, 약 100일 정도의 짧은 생육 주기, 적은 생산 비용, 종자 내 높은 불포화 지방산 함유량이 특징인 바이오에너지 작물로, 다양한 환경 스트레스에 상대적으로 내성을 보여준다. Rare Cold Inducible 2 (RCI2) 단백질은 저온 뿐만 아니라 염분, 가뭄, 고온 등의 다양한 환경 스트레스에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 카멜리나의 CsRCI2 단백질 패밀리는 C-terminal tail의 유무에 따라 tail type (CsRCI2D,E,F,G)와 no-tail type (CsRCI2A,B,C,H)로 구성되어 있으며, 공통적으로 2개의 transmembrane domain을 가지고 있다. 이전 연구에서 tail type인 CsRCI2E 단백질은 염분 및 저온 스트레스에서 발현이 크게 증가하였으며, 가뭄 스트레스 하에서도 발현이 유도되었으나, 삼투 스트레스에서의 연구는 여전히 부족하다. 삼투 스트레스는 식물의 뿌리에서 수분 흡수를 방해하여 식물의 생장과 발달에 영향을 미치는 환경 스트레스이다. 따라서 삼투 스트레스에 대한 뿌리에서의 초기 대응이 식물의 스트레스 내성 기작에서 매우 중요하다. 카멜리나의 뿌리는 높은 농도의 NaCl 스트레스 조건에서 광범위하게 산화 스트레스 피해를 보이는 반면, mannitol 스트레스 하에서는 뿌리 끝으로부터 1mm 이내의 특정 부분에 집중적인 피해를 나타냈다. 카멜리나의 뿌리에서 CsRCI2E 유전자의 발현 수준을 분석한 결과, mannitol 스트레스와 NaCl 스트레스에서 각각 다른 발현 패턴을 나타냈다. 따라서 본 연구에서는 CsRCI2E 과발현체를 제작하여 카멜리나의 생리적 반응을 관찰하였다. CsRCI2E 과발현체는 mannitol 또는 NaCl 스트레스 조건 하에서 동시간의 WT에 비해 높은 발아율과 빠른 뿌리 성장을 나타냈다. 또한, 각각의 삼투 스트레스 하에서 WT에 비해 CsRCI2E 과발현체 뿌리의 H2O2 및 MDA의 축적이 크게 감소하였다. 또한 CsRCI2E 유전자 과발현에 의해 mannitol 또는 NaCl 스트레스 하에서 ROS-scavenging 관련 유전자의 발현이 증가하였다. 이는 CsRCI2E 유전자가 삼투 스트레스 하에서 카멜리나의 뿌리의 산화 스트레스 피해를 감소시킴으로써 삼투 스트레스 내성을 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다. 한편, CsRCI2E 단백질을 eYFP 형광 단백질과 융합하여 세포 내 발현 위치를 관찰하였을 때, 단백질은 원형질막에 주로 분포하였으며, 일부 세포에서는 소낭 형태로 세포 내부로 이동하는 형태를 나타냈다. Sucrose gradient 방법을 통해 막 단백질의 밀도별 분포를 분석했을 때, CsRCI2E 단백질이 mannitol 스트레스와 NaCl 스트레스에 의해 redistribution 되는 것을 확인하였다. 이를 통해 CsRCI2 단백질이 삼투 스트레스 조건에서 내포작용을 통해 스트레스 내성에 기여할 것으로 추측하였다. 따라서 뿌리 조직의 단백질 redistribution 분석이 추가적으로 필요하다고 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 1
• 서언 3
• 재료 및 방법 5
• 1. 식물 재료 및 스트레스 처리 5
• 2. CsRCI2 과발현 형질전환 카멜리나 제작 5
• 3. 담배 잎에서 CsRCI2 단백질들의 세포 내 발현 위치 분석 5
• 4. 막 단백질 추출 및 sucrose density gradient 분석 6
• 5. DAB(3,3‘-diaminobenzidine) 염색 6
• 6. Hematoxylin 염색 6
• 7. H2O2와 MDA 함량 측정 6
• 8. Quantitative RT-PCR 분석 7
• 9. 통계 분석 7
• 결과 10
• 1. 카멜리나의 RCI2 단백질 서열 비교 및 CsRCI2E 단백질의 구조 예측 10
• 2. 삼투 스트레스 하에서 WT과 CsRCI2E 과발현체의 비교 및 분석 13
• 2.1 WT과 CsRCI2E 과발현체의 발아율 및 뿌리 길이 분석 13
• 2.2 WT과 CsRCI2E 과발현체의 ROS 축적 분석 17
• 3. 야생형 카멜리나의 환경 스트레스에 의한 뿌리 피해 분석 20
• 4. WT과 CsRCI2E 과발현체의 뿌리 피해 분석 23
• 5. CsRCI2E 단백질의 세포 내 발현 위치 분석 25
• 6. CsRCI2E 단백질의 subcellular redistribution 분석 27
• 고찰 29
• 참고문헌 33
• 영문초록 36