Effect of bay laurel (Laurus nobilis L.) leaves water extracts on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chapter 3

Non-alcoholic fatty liver disease (NALFD) is lipid accumulation in liver without alcohol, it affects many people worldwide. NALFD occur to be associated with metabolic syndrome disease such as obesity, insulin resistance, hyperlipidemia, and diabetes. However, there is no pharmacologic therapies for NALFD. Recently, there is increasing reports that several natural plant can inhibit lipid accumulation in hepatocytes. Bay laurel
(Laurus nobilis L.) leaves have been used in traditional medicine for rheumatism, stomachache, emetic, skin
rashes, and earaches. Our objective was to investigate effect of bay laurel leaves water extract (BLW) on high fructose, high fat (HFHF) diet in a mouse model of NAFLD. Mice were ranomly divided into six groups: a normal AIN93G diet group (normal control;NC), a 10% high fructose+60% high fat diet group (HFHF), a 10% high fructose+60% high fat diet including 30 mg/kg body weight of silymarin extracts (positive control;HFHF+PC), a 10% high fructose+60% high fat diet including 50 mg/kg body weight of BLW group (HFHF+50), a 10% high fructose+60% high fat diet including 100 mg/kg body weight of BLW group (HFHF+100), a 10% high fructose+60% high fat diet including 200 mg/kg body weight of BLW group (HFHF+200). The mice were fed high fat diet add each concentration of BLW which is based on AIN93G and were fed gavage of 10% fructose solution. After 12 weeks, mice were sacrificed. Serum ALT, AST, and GGT levels in BLW supplementation group were significantly decreased compared with the HFHF group. Hepatic TC, TG, SOD, CAT, and GPx levels were significantly decreased in the HFHF+100 and HFHF+200 groups compared to the HFHF group. Expression of proteins related to hepatic lipogenesis was decreased in the BLW supplementation groups compared to the HFHF group. Furthermore, the expression of proteins related to hepatic inflammation and apoptosis was reduced in the BLW supplementation groups compared to the HFHF group. These results suggest that BLW could potentially useful in the treatment of NAFLD due to its inhibitory effects on hepatic lipogenesis, hepatic inflammation, and hepatic apoptosis.

국문 초록 (Abstract)

간에서 관찰되는 대표적인 만성 대사 증후군으로 알려진 지방간질환은 간 조직 내 지방 함량이 증가한 상태를 말하며 단순 지방 침착에서부터 지방간염까지 다양한 증상이 발현되는데 그 중에서 비알코올성 지방간은 간 조직 내 지방 축적은 보이나 음주, 약물, C형 감염 등의 특정 원인 없이 발병하는 경우를 말한다. 비알코올성 지방간은 고지혈증, 당뇨, 비만, 고혈압 등과 밀접한 관계가 있으며, 간 내 지방축적이 높은 상태가 지속될 경우 염증반응이 진행되는 원인에 대해 ‘two-hit’ 이라는 가설이 많은 연구에서 보고되고 있다. 간세포의 세포질에 중성 지방이 축적되는 것을 첫번째 hit이라고 하고, 지방 축적이 지속되어 ER스트레스, 산화적 스트레스, 미토콘드리아 기능장애 등과 같은 염증반응이 나타나게 되는데 이것을 두번째 hit라고 한다. 이러한 과정이 지속되면 간섬유화 또는 간경변으로 진행되어 말기 간 질환으로 발전하게 된다. 최근 전세계적으로 비알코올성 지방간의 유병률이 증가하고 있는 추세인데 이는 운동부족과 서구화된 식생활으로 인해 발병하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 현재까지 비알코올성 지방간의 치료는 대사증후군에서 권장하는 치료법과 유사하게 신체활동 증가, 식습관 변화, 체중 감소를 포함하는 lifestyle 변화에 중점을 두고 있다. 또한 많은 연구자들이 천연물을 통한 기능성 연구를 활발히 진행하고 있다.
월계수 잎은 상록 교목으로 생잎은 약간 쓴맛이 있으나 건조시킨 잎은 단맛이 강하고 독특한 향기가 있어 향신료로 주로 이용된다. 월계수 잎에는 sesquiterpene lactones, alkaloids, glycosylated flavonoids (isoquercetin), flavonols (myricetin, quercitin, and kaempferol), flavones (luteolin and apigenin), germarcrane alcohols 등과 같은 다양한 phytochemical이 존재하고 이러한 성분들이 항산화, 항염증 등과 같은 역할 하여 류마티스의 진통제, 발진, 소화제, 수렵제, 구충제 등으로 사용되어왔다.
본 연구에는 세포 실험 및 동물실험을 통해 비알코올성 지방간에서 월계수 잎 열수추출물(BLW)의 효과에 대해 알아보고자 하였다. 세포실험에서는 free fatty acid를 간세포 (HepG2)에 처리하여 지방간을 유도하였고, 동물실험에서는 고지방식이 및 고과당을 섭취하여 지방간을 유도하였으며 12주간 실험을 진행한 뒤 지질지표, 항산화지표, 지방 합성 관련 인자, 염증 관련 인자 및 apoptosis 관련 인자들과 조직형태학적 분석을 실시하였다. 지방간을 유도한 세포 및 간 조직에서 지방구의 생성이 확인되었고, BLW의 처리시 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 항산화지표인 SOD, CAT, GPx 활성은 지방간 유도 시 감소하였으나, BLW의 처리시 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 지질과산화물은 지방간 유도 시 증가하였으나 BLW의 처리시 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 지방간 유도로 증가한GLUT2, CD36과 같은 transporter의 단백질 발현이 BLW로 인해 감소하였고, Sirt1, p-AMPK/AMPK의 단백질 발현은 BLW의 처리로 인해 증가하여 SREBP-1c의 단백질 발현을 감소시켰다. 또한, BLW 처리가 p-ACL/ACL, p-ACC/ACC의 단백질 발현을 증가시켰고, FASN 단백질 발현을 감소시키며, PPAR-α 및 CPT1A 단백질 발현을 증가시켜 β–oxidation을 유도하였음을 확인하였다. 간 조직 내 과도한 지방 축적은 ROS를 유도하여 염증을 유발하는데, BLW의 처리가 IκB, NF-κB, COX-2, iNOS 과 같은 염증 관련 인자와 JNK, BAX/Bcl-2, CD95, FADD, C-CAS8, C-CAS3과 같은 apoptosis 관련 인자의 단백질 발현은 감소시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 토대로, 월계수 잎 열수추출물은 간 조직 내 중성지방의 생성 및 축적을 억제하여 비알코올성 지방간을 예방하는 효과를 가지는 것으로 보이며, 염증 및 apoptosis억제에도 도움을 주는 것으로 보여진다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chapter 2

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the accumulation of more than 5% fat in the liver without alcohol and a hepatic lipid metabolism disorder cause by various cause in worldwide. Free fatty acid (FFA) could be taken up by hepatocytes and provide as important source for triglyceride (TG) synthesis in hepatocytes. NAFLD is no approved pharmacologic therapies, so treatment for NAFLD has focused on lifestyle change. Many researches were reported that natural plants can protect fatty liver disease. Bay laurel (Laurus nobilis L.) contain various phytochemical agents and have been used in tradition medicine as an anti-emetic, and to treat earaches, stomach aches, rheumatism, and skin rashes. However, it is unclear if bay laurel leaves water extract (BLW) was able to protect against NAFLD in vitro. We propose that whether bay laurel leaves water extract (BLW) could be prevent NAFLD. HepG2 cells were treated with BLW (50, 100, and 200 μg/mL) and isoquercetin (IQ; 10, 20 mM) for 4 h, after free fatty acid solution (palmitic acid : oleic acid, 1:2) was treated for 24 h. We were determined by the lipid accumulation using oil red O staining, antioxidant activities, MDA levels, and protein expression using western blot assay. Lipid accumulation in HepG2 cells treated with FFA were increased in the control group, whereas BLW and IQ pre-treatment were reduced lipid accumulation to a level comparable to that in the control group. Cellular SOD, CAT, GPx, and MDA levels were similar in the BLW and IQ pre-treatment groups to those in the control group. Expression of CD36, SREBP-1c, and FASN as assessed by western blot was decreased in the BLW and IQ pre-treatment groups, while the expression of p-AMPK/AMPK, p-ACL/ACL, p-ACC/ACC, PPAR-α, and CPT1A was increased in the BLW and IQ pre-treatment groups. Furthermore, the expression of proteins of p-IκB/IκB, p-NF-κB/NF-κB, COX-2, and iNOS was reduced in BLW and IQ pre-treatment groups compared to the control group. In addition, the expression of proteins of p-JNK/JNK, BAX/Bcl-2, CD95, FADD, C-CAS8, and C-CAS3 was reduced in BLW and IQ pre-treatment groups compared to the control group. These results suggest that BLW and IQ protect against FFA induced fatty liver disease by attenuating lipid accumulation, inflammation, and apoptosis in hepatocytes.

목차 (Table of Contents)

• TABLE OF CONTENTS
• Table of Contents i
• List of Figures ⅲ
• List of Tables viii
• List of Abbreviations ix
• Chapter 1. Literature Reviews 1
• Ⅰ. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) 2
• 1. NAFLD definition and current perspectives 2
• 2. Dietary induced animal models of NAFLD 5
• 3. Liver function biomarkers in NAFLD 6
• 4. Hepatic lipid accumulation pathways 7
• 5. Hepatic inflammation and apoptosis pathways 9
• Ⅱ. Effect of bay laurel (Laurus nobilis L.) 11
• 1. Bay laurel (Laurus nobilis L.) 11
• 2. Physiological activity of Bay laurel (Laurus nobilis L.) 12
• Ⅲ. Reference 13
• Chapter 2. Effect of bay laurel (Laurus nobilis L.) leaves water extracts on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in free fatty acid treated HepG2 cells 25
• Abstract 26
• Ⅰ. Introduction 28
• Ⅱ. Materials and methods 30
• Ⅲ. Results 36
• Ⅳ. Discussion and conclusion 74
• Ⅴ. Reference 77
• Chapter 3. Effect of bay laurel (Laurus nobilis L.) leaves water extracts on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in mice fed high-fructose, high-fat diet 82
• Abstract 83
• Ⅰ. Introduction 85
• Ⅱ. Materials and methods 87
• Ⅲ. Results 91
• Ⅳ. Discussion and conclusion 135
• Ⅴ. Reference 138
• Major Findings 144
• Abstract in Korean 148