Novel three-dimensional ex vivo cell expansion platform for diagnosis and treatment of intractable diseases : Part I. Intramyocardial delivery of human cardiac stem cell spheroids with enhanced cell engraftment ability and cardiomyogenic potential for myocardial infarct repair; Part. II Clinical significance of identified circulating tumor cells in predicting early metastasis in non-small cell lung cancer patients = 난치병 진단 및 치료를 위한 세포의 3차원 ex vivo 배양

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

PART I.
Stem cell-based cardiac regeneration and repair strategies are crucial for patients with ischemic heart disease (IHD) who have persistent problem from ischemic necrosis. Because of their unique cardiac-lineage commitment, cardiac stem cells (CSCs) have proven great therapeutic effectiveness for IHD therapy. The therapeutic potential of CSCs could be further enhanced by designing a cellular spheroid formulation. The spheroid culture conditions for CSCs were optimized to guarantee controlled size and minimum core necrosis. CSC spheroids had greater expression levels of mRNA profiles associated with cardiac regeneration, angiogenesis, anti-inflammatory, and cardiomyocyte differentiation than CSCs. In the rat IHC model, intramyocardially administered CSC spheroids significantly promoted cardiac generation: reduced infarction and fibrotic area and increased left ventricle thickness compared to the untreated group. Cardiac performance was also enhanced by increasing the ejection fraction and fraction shortening. Intramyocardial administration of CSC spheroids might be a cutting-edge treatment approach for cardiac repair following a myocardial infarction, with enhanced cell engraftment and regenerative potential.
PART II.
Cancer specimens obtained through surgical excision or biopsy are frequently utilized to study tumor-related changes. These methods, however, may not always be practical due to their invasiveness, and they may not represent current tumor dynamics, which may alter throughout therapy. As a result, several research teams have concentrated on developing non-invasive biomarkers that can track tumor dynamics. Circulating tumor cells (CTCs) are metastatic cells that are discharged into the bloodstream from a primary tumor. CTC dissemination is an important step in the metastatic cascade that leads to overt metastasis to distant sites. CTCs have piqued the interest of researchers because they are easily accessible and outperform traditional tumor indicators. Unfortunately, CTCs exist at a low concentration in the blood and their heterogeneous nature impedes their complete understanding. The aim of this study was to successfully detect the CTCs found in the peripheral blood of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and investigate their correlation to clinical data. CTCs in the bloods of NSCLC patients were identified by immunofluorescence staining utilizing reported epithelial and mesenchymal CTC markers. The findings of this study suggest that CTCs could be used as a non-invasive diagnostic and prognostic tool in NSCLC.

국문 초록 (Abstract)

3차원 세포 배양법은 기존의 단층 배양법보다 조직의 실제 구조를 체외에서 효과적으로 모방할 수 있기 때문에 많은 연구에서 적용하고 있다. 생체와 유사한 환경을 체외에서 인공적으로 형성하여 생체내 세포와 동일하게 주변 환경과 상호작용할 수 있도록 한다. 또한, 영양분, 산소 등이 구배확산(gradient diffusion)으로 세포에 공급되어 생체와 유사한 환경을 제공하고 세포-세포 그리고 세포-세포외기질의 3차원 접촉으로 인한 상호작용을 가능하게 한다. 반면 2차원 세포 배양법은 세포를 플라스틱 접시에 부착시켜 단일층으로 증식하므로 생체내에 존재하는 세포와 형태뿐만 아니라 유전자의 발현 정도에도 차이가 있으며 생체내 세포와의 대응성도 떨어진다.
이에 더하여 저산소증 및 저영양소 공급 그리고 염증반응으로 인하여 이식된 줄기세포는 임상적으로 낮은 효율성을 보인다. 이는 줄기세포 기반 치료법의 최적화를 위하여 이식되는 세포 처리과정 및 제조과정의 개선이 필요함을 나타낸다. 다수의 보고된 연구결과에 의하면 3차원 배양법을 통해 항염증, 혈관신생능력이 증가하며 줄기세포의 생존율을 개선함으로써 줄기세포 미세구(spheroid)를 생체에 이식하였을시 전반적인 능력이 향상된다는 것을 확인하였다. 따라서 줄기세포의 spheroid 생성은 임상 연구 및 치료에서 줄기세포의 적용을 확대할 수 있는 가능성을 보여준다. 본 연구에서 사용한 뇌사자 및 환자의 심근으로부터 분리된 심장줄기세포의 경우 3D 배양환경에서 형성된 spheroid에서 자발적인 심근세포로의 분화가 확인되었으며 oxidative stress에 대한 저항성이 증가되어 2D 배양된 심장줄기세포 대비 심장줄기세포 미세구의 심근재생능력 및 손상된 심기능이 심근경색모델에 이식하였을 시 유의미하게 향상됨을 확인할 수 있었다.
암과 관련된 사망의 대부분은 타 장기로의 전이로 인한 것이며 1차종양에서 유래하여 혈액에서 순환하는 순환종양세포(CTCs)는 전이의 전구체 역할을 한다. 순환종양세포는 암환자를 위한 새로운 예후와 진단 마커로 많이 주목받고 있으나 암전이에 있어 순환종양세포의 생물학적 역할에 대해서는 현재까지도 연구가 진행중이다. 순환종양세포의 생물학적 측면, 이질성, 그리고 타세포와의 상호장용에 대한 이해는 암치료를 위한 항암제로서 효과적인 사용이 가능하게 해줄 뿐만 아니라 암 전이과정의 이해도를 높이는 데에도 도움이 될 수 있다. 하지만 혈액 내 미량 존재하는 순환종양세포는 특이적으로 분리하여 높은 순도의 세포를 분리한다 하더라도 그 수로 인하여 연구에 어려움이 있다. 앞의 이유로 여러 연구자들은 순환줄기세포의 배양을 통한 수의 증가에 도전하고 있으나 성공률은 다소 낮은편이다. 본 연구에서는 순환종양세포-특이 배양액을 이용하여 비소세포성 폐암 환자의 혈액서 분리된 순환종양세포를 배양하였다. 면역형광법을 이용하여 배양전과 배양후에 판별된 순환종양세포의 수를 비교하였고 이를 임상정보과 비교 분석하였다. 총 39명의 환자 중 6명의 환자에서 순환종양세포의 수가 증가함을 확인하였고, 판별된 순환종양세포의 수는 비소세포성 폐암환자의 암병기, 림프절 전이 및 원거리 전이와 상관성이 있다는 결과를 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• Part I. Intramyocardial delivery of human cardiac stem cell spheroids with enhanced cell engraftment ability and cardiomyogenic potential for myocardial infarct repair 1
• Abstract 2
• A. Introduction 3
• B. Materials and Methods 5
• 1. Animals and reagents 5
• 2. Isolation and cultivation of cardiac stem cells (CSCs) 5
• 3. Immunophenotypic analysis of CSCs 6
• 4. Growth kinetic analysis of CSCs 7
• 5. Fabrication of CSC spheroids 8
• 6. Live and dead assay 8
• 7. Adenosine triphosphate (ATP) cell viability assay 9
• 8. Gene expression profiling of CSC spheroids 9
• 9. Quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) 10
• 10. Immunofluorescence staining of CSC spheroids 10
• 11. Myocardial ischemic/reperfusion (I/R) injury model and cell transplantation 11
• 12. Ex vivo imaging analysis 12
• 13. Immunohistochemical analysis 12
• 14. Echocardiographic analysis 13
• 15. Statistical analysis 13
• C. Results 15
• 1. Immunophenotypic characterization of CSCs 15
• 2. CSC clonogenicity and long-term growth potential 15
• 3. CSC spheroid growth optimization and characterization 17
• 4. Gene expression profile of CSC spheroids 21
• 5. Cardiomyocyte differentiation potential of CSC spheroids 23
• 6. Engraftment of CSC spheroids in the infarcted myocardium 25
• 7. Cardioregenerative effect of CSC spheroids in the infarct myocardium 25
• 8. Functional improvement of infarcted heart by CSC spheroid treatment 30
• D. Discussion 32
• E. Conclusion 36
• References 37
• Part II. Clinical significance of identified circulating tumor cells in predicting early metastasis in non-small cell lung cancer patients
• Abstract 41
• A. Introduction 42
• B. Materials and Methods 45
• 1. Reagents 45
• 2. Clinical samples 45
• 3. Isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 46
• 4. Ex vivo 3D enrichment of circulating tumor cells (CTCs) 47
• 5. Immunofluorescence staining 48
• 6. Statistical analysis 49
• C. Results 50
• 1. Patients' characteristics 50
• 2. Identification and classification of CTCs 51
• 3. Short-term ex vivo expansion of CTCs 51
• 4. Correlation between age, gender, histologic subtype, differentiation, and smoking and the detection rate of CTCs 54
• 5. Correlation between TNM stages and the detection rate of CTCs 55
• 6. Correlation between lymph-node metastasis and the detection rate of CTCs 56
• 7. Correlation between distant metastasis and the detection rate of CTCs 56
• D. Discussion 63
• E. Conclusion 65
• References 66
• Abstract (in Korean) 68
• Acknowledgement 71