AMP-activated protein kinase activation attenuates angiotensin II-induced vascular contraction by suppressing caclium signaling in vascular smooth muscle cells

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

AMP-activated protein kinase (AMPK) is a serine/threonine kinase that regulates intracellular energy level. AMPK is also involved in diverse physiological pathways including inflammation, cell proliferation, and fatty acid oxidation. Vascular protective effects of AMPK activators such as metformin or thiazolidinedione were investigated in the previous studies, but the underlying mechanism is elusive. This study aims to investigate the vascular protective role of AMPK activation via regulating vascular contractile response. Intracellular calcium (Ca2+) signaling plays a critical role in the vascular smooth muscle cells (VSMCs) contraction. Hence, impaired regulation of intracellular Ca2+ elevation causes abnormal vascular contraction. Excessive vasoconstriction is known as one of the important causes for cardiovascular disease. In this study, the effect of AMPK activation on vascular contraction was investigated in cultured VSMCs and isolated aorta. Activation of AMPK was detected by immunoblotting analysis of phosphorylation of Thr172-AMPKα (p-AMPKα) and total AMPK protein level. Acknowledged AMPK activators 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotides (AICAR) and A769662 could successfully stimulate AMPK in rat VSMCs. Effect of AMPK activation on intracellular Ca2+ in VSMCs was measured by ratiometric fluorometric Ca2+ indicator fura-2 with live cell imaging system. VSMCs treated with angiotensin II (Ang II) or 5-hydroxytryptamine (5-HT) evoked Ca2+ signaling in VSMCs. AMPK activation attenuated Ca2+ elevation induced by Ang II, but not by 5-HT. Based on the previous study about the contribution of reactive oxygen species (ROS) to the Ang II-induced vascular contraction, the effect of AMPK activation on the Ang II-induced ROS generation was investigated. Ang II-stimulated ROS generation in VSMCs was measured by fluorometric superoxide indicator dihydroethidium (DHE). Ang II-stimulated ROS generation was reduced by AMPK activation. Similarly, in isolated rat thoracic aorta, AICAR was capable of stimulating AMPK and AMPK activation significantly reduced vascular contraction induced by Ang II, but not by 5-HT or PE. High K+-induced Ca2+ elevation-dependent vascular contraction of isolated aorta was not affected by AMPK activation. Taken together, AMPK activation in VSMCs results in attenuation of Ang II-induced vasoconstriction by suppressing Ca2+ elevation. Decrease in vascular reactivity to Ang II may contribute to the vascular protective effect of AMPK activators.

국문 초록 (Abstract)

AMP 활성화 단백질 키나제는 serine/threoinine 단백질 키나제로 세포내 에너지 수준을 조절한다. AMPK는 염증, 세포 증식 그리고 지질 산화 등의 다양한 생리활성 경로에 관여한다. 이전의 연구를 통해 metformin 혹은 thiazolidinedione과 같은 AMPK 활성화제의 혈관보호효과가 알려져 있으나 명확한 기전은 밝혀지지 않았다. 본 연구는 AMPK 활성화의 혈관 수축반응 조절을 통한 혈관보호효과를 밝히고자 수행되었다. 세포내 칼슘신호는 혈관 평활근세포 수축에 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 세포내 칼슘증가의 조절의 손상은 비정상적인 혈관수축을 유발한다. 과도한 혈관수축은 심혈관계질환의 중요한 원인 중 하나로 알려져 있다. 해당 연구에서, 혈관수축에서 AMPK 활성화의 효과를 배양된 혈관 평활근세포와 분리된 대동맥 혈관에서 관찰하였다. AMPK의 활성화는 인산화된 Thr172-AMPKα (p-AMPKα)와 총 AMPKα 단백질의 면역블롯을 이용하여 측정하였다. 랫드에서 분리한 혈관 평활근세포에 잘 알려진 AMPK 활성제인 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotides (AICAR)와 A769662를 처리하였을 때 AMPK는 단시간안에 활성화되었다. 혈관 평활근세포에서 세포내 칼슘과 그 조절에 AMPK의 활성화가 미치는 영향은 칼슘에 대한 형광 지시약인 fura-2를 이용해 측정되었다. 세포내 칼슘 신호의 유발을 위하여 안지오텐신 II (angiotensin II, Ang II)와 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)을 혈관 평활근세포에 처리하였다. AMPK의 활성화는 Ang II에 의한 세포내 칼슘의 증가를 저해하였으며, 5-HT에 의한 칼슘 신호에는 영향을 미치지 않았다. Ang II에 의한 혈관수축에 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 기여에 관한 이전 연구에 기반하여 혈관 평활근세포에서 Ang II 유래 ROS의 생성에 AMPK 활성화가 미치는 영향을 측정하였다. 혈관 평활근세포에서 Ang II에의한 ROS 생성은 superoxide 음이온에 대한 형광 시약 dihydroethidium을 이용해 측정되었다. AMPK 활성화에 의해 Ang II에 의한 ROS의 생성은 감소하였다. 혈관 평활근세포와 마찬가지로 AMPK 활성제 AICAR는 랫드에서 분리한 흉부 대동맥 혈관의 AMPK를 활성화하였다. Ang II, 5-HT 그리고 페닐에프린으로 혈관 수축을 유발하였을 때, Ang II에의한 혈관수축은 AMPK의 활성화에 의해 억제되었다. 고농도의 칼륨을 포함한 용액을 이용해 직접적인 칼슘증가를 통해 혈관수축을 유발하였을 때, AMPK가 활성화된 분리된 동맥은 대조군과 차이를 보이지 않았다. 해당 결과를 종합하였을 때, AMPK의 활성화는 Ang II에 의한 혈관 평활근세포 내 칼슘의 증가를 억제함으로 혈관 수축을 저해하였다. 따라서 AMPK 활성제에 의한 혈관보호효과는 AMPK의 활성화에 의해 발생하는 Ang II에 의한 혈관 수축반응의 감소에 기인하는 것으로 보인다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT i
• TABLE OF CONTENTS iii
• LIST OF FIGURES v
• LIST OF ABBREVIATION vi
• INTRODUCTION 1
• MATERIAL AND METHODS 4
• Reagents 4
• Animals 4
• Cell culture 5
• Evaluation of AMPK activation in cultured VSMCs and isolated aorta 6
• Intracellular calcium measurement 7
• Intracellular superoxide measurement 7
• Measurement of isolated aortic ring tension 8
• Statistical analyses 9
• RESULTS 10
• AMPK activation inhibited Ca2+ elevation and ROS generation by Ang II in VSMCs 10
• AMPK activation attenuated vascular contractile response to Ang II, but not to 5-HT or PE 15
• AMPK activation did not affect vasoconstriction induced by direct Ca2+ elevation 18
• DISCUSSION 20
• REFERENCES 24