Genome-wide analysis of novel triple-reassortant swine influenza A virus isolated in Korea

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The H1N2 subtype influenza A virus is predominantly circulating in pigs together with H1N1 and H3N2 subtype viruses. Since 2001, eight subtypes (H1N1, H1N2, H3N1, H3N2, H5N2, H7N2, H9N2, and H11N6) of swine influenza virus (SIV) have been reported in Korean pigs. To better understand the evolutionary dynamics of SIVs in Korea, a total of 241 nasopharyngeal specimens were collected from farmed pigs, and four SIVs were isolated from them. After obtaining whole-genome sequences of these SIVs by a next-generation sequencing method, phylogenetic relationships of eight gene segments of the isolated SIVs were investigated using a Bayesian inference method. Given the phylogenetic clustering patterns, the four SIVs appeared to be novel triple-reassortant H1N2 viruses whose eight gene segments were originated from three different genetic lineages; Eurasian avian-like (EA) lineage (HA gene), triple-reassortant internal genes (TRIG) lineage (PB2 and NA genes), and 2009 pandemic (PDM) H1N1 lineage (PB1, PA, NP, M, and NS genes). In the HAs of the four SIVs, 12 amino acid mutations were identified, and six of them were found at HA antigenic sites, such as Sa (L164I, S165N), Sb (S189R, D190G/V), and Ca1 (G173E, G205E). Especially, the D190G/V mutation is located at the region of receptor binding specificity determinant, and the N-linked glycosylation modification mutations (A96T and S165N) are also found around the HA globular head region. Considered together, these results provide molecular evidences of ongoing genetic reassortment events and evolutionary dynamics of SIVs in Korean pigs by highlighting the need of year-round, nation-wide surveillance networks to prepare against potential SIV pandemic.

국문 초록 (Abstract)

인체 감염 시 급성 호흡기 질환을 야기하는 A형 인플루엔자 바이러스는 야생 물새가 자연 숙주인 것으로 알려져 있다. 사람, 돼지, 말 등을 비롯한 포유 동물과 오리, 닭 등의 조류가 주요 숙주이고, 표면항원단백질인 hemagglutinin (HA)의 수용체 결합 특이성에 의해 이종 숙주 간 감염, 전파 장벽이 존재하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 돼지는 호흡 상피에 조류 및 사람 인플루엔자 바이러스 감염에 적합한 수용체를 모두 보유하고 있고, 이러한 특성으로 인해 이종 바이러스 간의 유전자 재편성을 야기하는 “mixing vessel” 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 전세계적으로 유행하고 있는 돼지 인플루엔자 바이러스(swine influenza virus, SIV) 주요 아형은 H1N1, H1N2, H3N2 등이고, 국내에서도 비슷한 아형의 바이러스들이 유행하는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 국내 유행 SIVs의 분자 진화 특성 분석을 위하여 2016년 4월부터 약 8개월 간 총 241건의 돼지 호흡기검체를 수집하였고, 이로부터 SIV 분리 및 유전자 정보 획득을 시도하였다. 그 결과, 서로 다른 네 종의 H1N2 바이러스(swPL16s)를 분리하였고, 차세대 염기서열분석법(next generation sequencing, NGS)을 이용하여 SIV 전장 유전체 서열을 획득하였다. 분리된 swPL16s의 8개 유전자 각각의 분자 진화 특성 분석 결과, swPL16s는 2009년 pandemic (PDM) H1N1 계통의 PB1, PA, NP, M, NS 유전자와 돼지 유래 triple-reassortant internal genes (TRIG) 계통의 PB2, NA 유전자, 그리고 돼지 유래 Eurasian avian-like (EA) 계통의 HA유전자로 구성된 신종 유전자 재편성 H1N2 바이러스임을 확인하였다. 이와 같은 유전자 조성을 갖는 바이러스가 국내외를 통틀어 아직까지 보고된 바 없음을 감안할 때, swPL16s는 2009년 PDM H1N1 바이러스 유전자 조성 기반 위에 국내 유행 SIV TRIG H1N2 바이러스 및 EA H1N1 바이러스 간의 유전자 재편성에 의해 생성된 것으로 추정할 수 있고, swPL16s의 HA 단백질에서 확인된 총 12개의 아미노산 돌연변이 중 7개의 변이가, 항원성 결정 부위인 Sa (L164I, S165N), Sb (S189R, D190G/V), Ca1 (G173E, G205E) sites 및 수용체 결합 특이성 결정 부위인 190번째 잔기(D190G/V), 당쇄화 잔기(94, 165)에서 발견된 점을 고려할 때, swPL16s의 항원성 변이, 수용체 결합 특이성 및 병원성 등의 in vitro/in vivo 실험을 통한 보다 면밀한 바이러스 특성 분석이 필요할 것으로 사료된다. 특히, 다양한 계통(PDM, TRIG, 및 EA)의 SIVs가 국내에서 유행하고 있고, 이들 바이러스 간의 유전자 재편성 및 신변종 인플루엔자 바이러스의 공중보건학적, 사회경제적인 위협을 감안할 때, 본 연구 결과는 국내 유행 SIVs에 대한 국가 차원의 감시 체계 확립 및 공공 유전자 데이터베이스 구축 필요성을 강조하는 것이다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract (Korean)
• I. Introduction 1
• II. Materials and Methods 4
• 1. Collection of swine nasopharyngeal specimens and virus isolation 4
• 2. Whole-genome sequencing of the isolated SIVs 5
• 3. Preparation of genomic sequence sets 6
• 4. Phylogenetic analysis of the isolated genes using the Bayesian inference method 8
• 5. Genetic characterization of the isolated SIVs 9
• 6. Unique amino acid mutations in the HA protein of the isolated SIVs 9
• 7. Evolutionary parameters of the isolated SIV genes 10
• III. Results 11
• 1. Isolation of H1N2 subtype SIVs from swine nasopharyngeal specimens 11
• 2. Phylogenetic relationships of the surface glycoprotein genes of the isolated SIVs 14
• 3. Phylogenetic relationships of the six internal genes of the isolated SIVs 21
• 4. Evolutionary dynamics profiles of the genetic segments of the isolated SIVs 35
• IV. Discussion 38
• Reference 42
• Abstract (English) 47
•