Development of structure refinement method to improve NMR protein structure accuracy = NMR 단백질 구조 정확도 향상을 위한 구조 개선 방법 개발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Determination of three-dimensional structure of protein is an important task in understanding their exact function and role in organism. More than 138,000 protein structures determined by X-ray, NMR (Nuclear Magnetic Resonance) are deposited in PDB (Protein Data Bank). There are about 11% of NMR structures in the whole structures of PDB and although the ratio increases gradually over the years, it still has a poor quality compared to the X-ray structure. The low quality of the NMR structure can be a hindrance to future drug development and structural research. Therefore, refinement is a necessary step for structural research using NMR structures. In this study, we introduce a method to improve the structural quality of NMR protein structure. Some of the problems of NOE experimental data obtained from NMR experiments were overcome and used for refinement. First, due to the ambiguity of NOE, it cannot be used immediately for structure calculation, and it requires handling procedure. The ambiguity is classified into four types and used for simulation after handling. Second, NMR structures with no NOE registered in the BMRB are difficult to improve. In order to improve the NMR structure regardless of the presence of NOE, a structure-derived distance restraint created from the hydrogen atom distance information obtained from a given structure was used in place of NOE to improve the structure. With these geometrical restraints, the statistical torsion angle potential (STAP) developed from the torsion angle population of high resolution X-ray structures was used. This contributed to the generation of secondary structures and improved Ramachandran accuracy. The refined structure has been measured for structural quality through various criteria: satisfaction of experimental data, geometrical/stereo-chemical protein quality, ensemble conservation degree and secondary structure ratio. After refinement, the refined structures were satisfied with the experimental data by having a much lower violation value than initial structure. The refinement protocol is built with a web server (NMRe), which allows the user to directly input the NMR structure to obtain refined structure, as well as providing various structural analysis results. The NMR structures with better reliability and accuracy than the initial structure can be expected to be more actively used in structural bioinformatics such as structure-based drug development and protein design.

국문 초록 (Abstract)

생체 내에서 발생되는 모든 생명 현상은 단백질의 3차원 구조와 밀접한 관련이 있고, 그 단백질의 구조와 기능에 대한 정보는 유전체에 의해 암호화 되어있다. 구조 유전체학 (structural genomics)에서는 high-throughput 방법을 통해 대량의 단백질 3차원 구조를 결정하고, 이를 바탕으로 단백질의 잠재적인 기능을 예측, 더 나아가 신약 개발 연구에 도움을 주는 것을 목표로 한다. High-throughput 방법 중 하나인 NMR (Nuclear Magnetic Resonance) 분광학은 구조 유전체학에서 중요한 역할을 한다. 다양한 기술 진보를 통해 발전된 X-ray 결정학은 고해상도의 구조를 만들어 내지만, 모든 단백질이 적합한 결정(crystal)을 제공하지는 않는다는 단점이 있다. 반면에, NMR 분광학은 생체 조건과 유사한 수용액 상태에서 실제 구조를 그대로 반영하여 결정하고, 핵 이완(nuclear relaxation)을 통한 구조의 역동성(dynamics) 정보와 화학적 이동(chemical shift)를 통한 구조와 기능간의 상관 관계 등을 관찰 할 수 있어 단백질 기능 규명에 많은 도움이 된다. 해를 거듭 할 수록 NMR 구조는 점점 정밀해지고 있지만 아직까지 X-ray 구조의 정밀도를 따라가지 못하고 있다. 이러한 정밀도 문제는 3차원 단백질 구조를 이용하는 연구에 NMR 구조가 제외되는 상황을 야기한다. 본 연구에서는 NMR 구조의 낮은 정밀도 문제를 해결하기 위해 컴퓨터 시뮬레이션을 통한 단백질 구조 개선 (refinement) 파이프라인을 개발하고, 웹 서버와 데이터베이스로 구축하였다. 구조 개선에 사용되는 거리 정보 구속 조건 (NOE; Nuclear Overhauser Effect)을 사용할 때 해결되어야 할 몇 가지 과제들이 존재했다. 첫 번째는 NOE 실험데이터의 부재, 두 번째는 NOE의 모호성 문제였다. 이러한 문제점들을 극복하기 위해 실험데이터 대신 주어진 구조 내의 수소 원자 거리정보를 사용하여 거리 구속 조건을 개발하였고, 구조 개선 파이프라인에 사용하였다. 이를 통해 거리 구속 조건이 갖는 문제점과 상관 없이 PDB에 게재된 대부분의 NMR 구조들을 개선할 수 있었다. 개선된 NMR 구조들은 초기 구조보다 기하학적/입체화학적 측면에서 상당히 높은 정밀도를 가졌고, 실제 실험데이터에 더 만족하는 결과를 보였다. 검증된 파이프라인은 웹 서버 ‘NMRe’에 응용되어 연구자들에게 공개되었다. 연구자들은 직접 NMR 초기 구조를 인풋으로 입력하여 개선된 구조를 얻을 수 있다. 또한 PDB에 등록 되어있는 대량의 NMR 구조들은 병렬 시뮬레이션을 통해 모두 개선된 후, 다양한 구조적 분석 결과와 함께 ‘STAP2’ 데이터베이스에 저장되었다. 이러한 웹 서버 및 데이터베이스는 실제로 단백질 구조가 다뤄지는 가상 스크리닝을 통한 구조 기반 신약 개발 연구, 단백질 디자인 및 기능 예측 등의 구조 유전체학/생물정보학 분야에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 예상한다.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록...................................................................................................... i
• Abstract..................................................................................................... iv
• Contents .................................................................................................... vi
• List of Tables ............................................................................................ ix
• List of Figures........................................................................................... xi
• 1. Strategy of NMR structure refinement without NOE.....................1
• 1.1 Introduction .....................................................................................1
• 1.2 Materials and methods ....................................................................4
• 1.2.1 Training and test sets .............................................................4
• 1.2.2 STAP and flat-bottom distance potential for structure refinement.........5
• 1.2.3 Two computational experiments ...........................................8
• 1.2.4 Simulated annealing (SA) protocol .....................................10
• 1.2.5 Structure validation scores...................................................10
• 1.3 Results ...........................................................................................13
• 1.3.1 Total score change as a function of flat-bottom width ........13
• 1.3.2 Optimization of flat-bottom width parameter for the training set ....20
• 1.3.3 Test refinement simulations with the optimal width ...........23
• 1.3.4 NMR refinement simulations for the entire width range.....27
• 1.3.5 Comparison with re-refinement method..............................35
• 1.4 Conclusions ...................................................................................37
• 2. NMRe : a web server for NMR structure refinement ...................38
• 2.1 Introduction ...................................................................................38
• 2.2 Materials and methods ..................................................................40
• 2.2.1 Two developed energy potentials ........................................40
• 2.2.2 Running a refinement ..........................................................40
• 2.2.3 Simulated annealing (SA) protocol .....................................42
• 2.2.4 Structural validation scores .................................................42
• 2.2.5 Analysis of averaged ensemble structure ............................44
• 2.3 Results ...........................................................................................45
• 2.3.1 Structural quality assessment...............................................45
• 2.3.2 Comparison between NMRe and two refinement methods ........51
• 2.3.3 The example of refinement result........................................51
• 2.3.4 Web server...........................................................................52
• 3. Refinement of whole NMR structures of PDB ...............................57
• 3.1 Materials and methods ..................................................................57
• 3.1.1 NMR structure collection and classification .......................57
• 3.1.2 Pre-processing of PDB file ..................................................57
• 3.1.3 Preparation of target energy ................................................58
• 3.1.4 Performing simulated annealing (SA) .................................61
• 3.1.5 Analysis of structural quality...............................................62
• 3.2 Results ...........................................................................................66
• 3.2.1 Comparison of structural quality: X-ray vs. NMR..............66
• 3.2.2 Comprehensive structural analysis of refined structures.....67
• 3.2.3 Contribution of components affecting structural improvement...75
• 3.2.4 Effect of protein structure quality on structural bioinformatics ..78
• 3.2.5 Database...............................................................................85
• 4. Appendix............................................................................................90
• 5. References ........................................................................................117