Systematic analysis of the pathogenicity-related signal pathways in human meningitis fungal pathogen

국문 초록 (Abstract)

크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)는 전세계에서 발병하는 진균성 뇌수막염의 주된 원인균이며 연간 60 만 명을 사망하게 한다. 그러나 진균 자체의 생물학적 연구 및 병원성 조절 신호전달 기작에 대한 연구가 매우 부족하다. 특히 감염 및 병 진행 과정에서 병원체가 숙주와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 완전한 이해가 부족하기 때문에 치료방법은 더더욱 제한적이다. 이번 연구는 크립토코쿠스 네오포만스에서 병원성을 조절하는 신호전달 경로의 전체론 적인 그림을 얻기 위해 인산화효소(kinase), 탈인산화효소(phosphatase)와 전사인자(transcription factor, TF)를 포함한 주요 신호전달 인자의 기능을 체계적으로 분석하는 것을 목표로 한다. 먼저 129 개의 kinase후보군에 대해 264 개의 표식인자(STM) 기반 유전자 결실 균주를 생성하고 30 가지의 다양한 시험관 내의 생장 조건 및 2 가지 다른 숙주(곤충 및 생쥐모델)에서 그들의 표현형 특성을 조사했다. 연구를 통해 병원성 진균의 생장 및 세포주기, 영양 대사, 스트레스 반응 및 적응, 세포 신호, 세포 극성 및 형태, 액포 수송, tRNA 변형 및 기타의 생물학적 범주에 속하는 63 가지 병원성 조절 kinase 및 그 기능을 확인했다. 또한 본 연구로 생성한 kinase 라이브러리 및 기존에 보고 된 TF 라이브러리를 사용하여 감염방법이 다른 2가지 STM 분석 실험을 수행하였고, 병원성 진균의 전체 감염 과정에서 총 183 kinase 및 178 TF의 NanoString 분석방법 기반 생체 내 전사물질 프로파일링 분석을 수행했다. 감염된 폐 및 뇌에서 수행한 STM분석 및 생체 내 전사물질 프로파일링 분석에 의해 병원성 진균은 감염 초기 및 후기 단계 모두에 필수적인 핵심 신호전달 경로뿐만 아니라 감염 단계 특이적 신호전달 경로를 활용한다는 사실이 밝혀졌다. 또한 병원성을 조절하는 주요 미토겐 활성화단백질 인산화효소(MAPK) 중 하나인 Hog1의 음성 피드백 조절자인 인산화 타이로신 탈인산화효소(PTP)인 Ptp1과 Ptp2에 대해서도 연구했다. Ptp2는 Hog1의과 인산화를 억제하고 HOG 경로의 음성 피드백 조절을 통해 생장, 유성생식, 스트레스 반응, 항진균제 내성 및 병원성 인자 조절을 중재하는 데 관여했다. 결과적으로 진균의 병원성에 있어서 Ptp2가 주된 역할을 하고 Ptp1이 보조된 역할을 했다. 수행된 전체 연구는 크립토코쿠스 네오포만스의 감염성을 조절하는 신호 회로에 대한 전문적이고 깊이 있는 정보를 제공하고 잠재적으로 항크립토코쿠스증 혹은 항진균 약물을 개발할 수 있는 약물 타깃 후보군을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cryptococcus neoformans is the leading cause of fungal meningoencephalitis worldwide, and causes more than million infections and 600,000 deaths annually. However, complex signaling networks which govern the pathobiological features of the basidiomycete fungal pathogen remain elusive. Moreover, therapeutic options for treatment of systemic cryptococcosis are even more limited, especially because. This study aims to systematically analyze the function of key signaling regulators, including kinases, phosphatases, and transcription factors (TFs), to obtain the holistic picture of pathobiological signaling networks in C. neoformans. To this end, first 264 signature-tagged mutagenesis (STM)-based gene-deletion strains for 129 putative kinases were constructed and their phenotypic traits were examined under 30 distinct in vitro growth conditions and in two different hosts (insect larvae and mice). The insect-killing based virulence assay and STM-based murine lung infectivity assay identified 63 pathogenicity-related kinases, which are involved in the following biological categories: growth and cell cycle, nutrient metabolism, stress response and adaptation, cell signaling, cell polarity and morphology, vacuole trafficking, transfer RNA (tRNA) modification and other functions. To further elucidate the infection-stage specific signaling pathways during the whole infectious process of C. neoformans, additional STM analysis of brain tissues intravenously infected with kinase mutant library constructed by this study and TF mutant library constructed by the previous study was performed and compared with data from the lung STM analysis. In addition, NanoString-based in vivo transcription profiling analysis was performed with probes of total 183 kinases and 178 TFs and total RNA recovered from infected host tissues (lung, brain, kidney, and spleen) at different infection stages of C. neoformans. This comparative dual-STM and in vivo transcription profiling analysis revealed that C. neoformans employs not only core virulence signaling pathways that are required for both initial and late stages of infection, but also utilizes infection stage-specific virulence signaling pathways. Finally, this study also characterized Ptp1 and Ptp2, two major protein tyrosine phosphatases (PTPs), which are the negative feedback regulators of core virulence signaling component Hog1, the stress-activated mitogen-activated protein kinase (MAPKs). Ptp2 suppressed the hyperphosphorylation of Hog1 and was involved in mediating vegetative growth, sexual differentiation, stress responses, antifungal drug resistance, and virulence factor regulation through the negative feedback loop of the HOG pathway. In contrast, Ptp1 was not essential for Hog1 regulation, despite its Hog1-dependent induction. However, in the absence of Ptp2, Ptp1 served as a complementary PTP to control some stress responses. Furthermore, Ptp1 and Ptp2 played minor and major roles, respectively, in the virulence of C. neoformans. This entire study provides insight into the comprehensive pathobiological signaling circuitries of C. neoformans and identifies potential anticryptococcal or antifungal drug targets.