전체엑솜서열을 이용한 한국인 특이적 SNP 프로파일링과 법과학적 활용

국문 초록 (Abstract)

짧은 직렬 반복 (short tandem repeat, STR) DNA 마커는 높은 개인 식별력으로 인해 법과학 분야에서 유전자 감식을 위한 DNA 마커 중 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나 높은 돌연변이 발생률과 증폭산물의 크기가 커서 미량 시료 분석에 있어 한계가 있다. 이를 보완하고자 비교적 돌연변이율이 낮고 증폭산물의 크기가 작은 단일 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)과 삽입-결실 다형성 (insertion-deletion polymorphism, INDEL) 분석에 대한 연구가 증가하고 있다. SNP는 낮은 돌연변이율로 친자확인 방법으로 적용할 수 있으며 인종이나 민족과 연관되어 인종 식별 방법으로 적용할 수 있다. 또한 차세대염기서열분석법 (next generation sequencing, NGS)의 도입으로 많은 수의 SNP 마커를 동시에 분석하여 그 식별력을 증가시킬 수 있게 되었다.
최근 외국인 관련 범죄 증가, 대량재난사고 발생 시 희생자의 국적 및 신원 확인 등의 사례들이 많아지면서 한국인을 식별할 수 있는 인종 특이적 DNA 마커 발굴의 필요성이 대두되고 있다. 이에 본 연구에서는 차세대염기서열분석 기술을 적용한 한국인 306명의 전체엑솜서열분석 (whole exome sequencing, WES) 데이터를 통하여 한국인 특이적인 SNP 마커를 선별하기 위한 필터링 파이프라인을 구축하였다. 최종적으로 높은 변별력을 가진 300개의 한국인 특이적 SNP 마커의 대량 발굴 및 법과학적 적용에 관하여 연구하였다.
전체엑솜서열분석 데이터에서 선별된 변이들로부터 법과학적 적용의 목적으로 비기능성 변이만을 선별하기 위해 스플라이싱 자리 (splicing site), 미스센스 (missense), 넌센스 (nonsense), 삽입/결실 (indel) 변이 등을 제거하였다. 한국인 특이적 변이만을 선별하기 위해 전 세계의 주요 인류 집단을 대상으로 한 1000 Genomes 데이터에서 드문 대립유전자 빈도 (minor allele frequency)가 0.3 이하이며 한국인 집단에서는 0.3 이상인 변이만을 선별하였다. 선별된 변이들은 Sanger 시퀀싱 방법을 통해 전체엑솜서열분석 결과의 정확성을 검증하였다.
구축된 필터링 파이프라인을 통해 선별한 변이들 중에서 마커 간 최소 거리가 2 Mb 이상이며 전체적으로 22개 염색체에 비교적 균등하게 분포하도록 최종 300개의 한국인 특이적 SNP를 선별하였다. 300개 SNP에 대한 한국인 집단의 드문 대립유전자 빈도는 0.415이며, 1000 Genomes 데이터의 평균 드문 대립유전자 빈도는 0.161로 세계적으로는 낮은 빈도를 보이는데 반해 한국인 집단에서는 비교적 높은 빈도를 보였다. 선별된 모든 SNP에서 하디-바인베르크 평형 상태에 있는 결과를 보였으며, 이형접합도 측정값 (Hobs)의 평균값은 0.476이며 이형접합도 예측값 (Hexp)의 평균값은 0.470로 나타났으며 누적 개인 식별력 (combined power of discrimination, CPD)은 매우 높게 나타났다. 또한 1000 Genomes 데이터의 다른 집단과 드문 대립유전자 빈도를 비교했을 때 동북아 지역의 집단 (중국, 일본)과 유사한 결과를 보였으며, 다른 지역의 집단 (유럽, 아메리카, 아프리카 지역 등)과는 큰 차이를 보였다. 이는 선정된 300개의 SNP 마커들이 동북아 특이적 특성을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
본 연구에서 구축한 필터링 파이프라인을 통해 선별된 SNP는 법과학적 적용을 목적으로 한 SNP 마커로 개발하여 범인의 인종을 구분하는데 유용하게 사용될 뿐 아니라 STR 분석에서 발생할 수 있는 단점을 보완하는 보조적 도구로서 국제적인 범죄 수사 공조에도 도움이 될 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Short tandem repeats (STRs) are the most powerful and frequently used DNA markers in human identification. Despite of their high discrimination power, STR typing has some limitations, such as large amplicon sizes, high mutation rates and presence of artifacts which can negatively influence the analysis of forensic samples. To overcome the limitations of STRs, single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertion/deletion polymorphisms (INDELs) have been recently introduced to the forensic identification field. However, in contrast to STRs, about four-times more SNP markers are required to reach the discrimination power equivalent to STR loci. To increase the power of discrimination of SNP markers, high-throughput processing of large target areas are needed. New DNA sequencing systems called next generation sequencing (NGS) have been developed in order to improve throughput and facilitate the establishment of large-scale datasets in a relatively short time. The advances in the NGS, forensic genetic laboratories have tried to develop new SNP markers to improve its discrimination power.
Recently, a necessity of developing ethnic group-specific SNP markers is arising because of the increasing criminals by foreigners and mass disaster cases to identify victim’s ethnicity. Here we established filtering pipelines for Korean-specific SNP selection from 306 Korean whole exom sequencing (WES) data and finally identified 300 Korean-specific SNPs.
Functionally significant SNPs (variants in splicing site, missense, nonsense, and exonic indel) were filtered out from the variant pool, and SNPs with minor allele frequencies (MAFs) of ≤ 0.3 in 1000 Genomes Database but > 0.3 in Koreans were selected. Genotypes obtained from WES were confirmed by capillary sequencing method. The identified markers were evenly distributed through the whole autosomal chromosomes. All the SNPs were in the Hardy-Weinberg equilibrium (p>0.05) with mean MAF of 0.415 (0.161 in 1000G). Mean heterozygosities were 0.476 (obs) and 0.470 (exp), respectively. The combined power of discrimination was very high. Korean MAFs in most markers were similar with Chinese and Japanese populations, but significantly higher than several other ethnic populations.
These selected SNPs will be used to develop forensic markers and are expected to be widely used for additional individual identification, ethnic discrimination, and linkage analysis for kinship test.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론
• 1-1. DNA 다형성과 법과학적 적용
• 1-2. 차세대염기서열분석(Next generation sequencing: NGS)
• Ⅱ. 재료 및 방법
• 2-1. 시료
• 2-2. 유전체 DNA의 추출
• 2-3. 전체엑솜서열분석 (Whole exome sequencing)
• 1) 엑솜 포획 (Exome capture)
• 2) 차세대염기서열분석 (Next generation sequencing)
• 3) 지도작성 (Mapping)
• 4) 변이정보 추출 (Variant calling)과 변이정보 주석달기 (Annotation)
• 5) 선별 (Filtering)
• 2-4. 한국인 특이적 SNP의 선별
• 2-5. Sanger 시퀀싱을 통한 전체엑솜서열분석 데이터의 정확도 검정
• 2-6. 집단 유전학적 통계 분석
• Ⅲ. 결 과
• 3-1. 한국인의 전체엑솜서열분석 대규모 데이터 확립
• 3-2. 한국인 특이적 SNP 선별을 위한 필터링 파이프라인 구축
• 3-2-1. 변이 정보의 통합
• 3-2-2. 비기능성 변이 선별
• 3-2-3. 한국인 특이적 변이 선별을 위한 기준 설정
• 3-2-4. SNP 유효성 확인
• 1) SNP 퀄리티 확인
• 2) 유일한 서열을 가진 변이 선별
• 3-3. 전체엑솜서열분석 데이터의 정확도 검정
• 3-4. 한국인 특이적 SNP 마커의 발굴
• 3-5. 집단 유전학적 통계 분석
• Ⅳ. 고 찰
• V. 참고문헌
• Abstract