Design, Synthesis and Anti-HCV Activity Evaluation of Novel Indole Analogues

국문 초록 (Abstract)

C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)는 전 세계적으로 약 1억 7천만 명이 감염되어 있는 수준으로 심각한 질병으로 분류된다. 현재 알려진 HCV 치료에는 페그인터페론-알파와 리바비린을 조합하여 사용하는 것이 일반적이다. 그러나 이 치료법은 HCV genotype 1형 환자 중 약 50%만 완전한 치료가 가능하고 여러 부작용을 동반하는 문제점이 있다. 또한, HCV 감염률이 지속적으로 증가하고 있어, 새로운 HCV 치료제의 개발이 필요하다. HCV 핵산 중합 효소는 바이러스 복제에 필수적이다. 이 때문에, 새로운 HCV 저해제타겟으로 바이러스 복제를 억제하는 연구가 활발하다. 본 연구에서는 Renilla luciferase-linked genotype 2a reporter virus를 이용해 동국대학교 in-house 화합물 라이브러리를 스크리닝 하였고, 그 결과 인돌계 화합물이 HCV 복제 저해에 활성이 있는 것을 확인하였다. 특히, genotype 2a J6/JFH1 RNA-transfected cell과 genotype 1b Bart79I subgenomic replicon cell을 통하여 인돌계 화합물이 바이러스의 게놈복제를 저해하는 사실을 확인하였다. 이러한 연구를 바탕으로 항-HCV 활성을 갖는 인돌계 화합물 유도체들을 고안하고, 인돌 고리에 치환되거나 치환되지 않은indole-3-carbaldehyde (3a-j)를 출발물질로 하여 Wittig 반응, 가수분해, 아미드커플링 반응 등 총 3 단계의 합성 단계를 걸쳐 인돌계 화합물 indole2-methylacrylamide (12a-j)를 합성하였다. 그 중에서 (E)-N-(4-tert-butylphenyl)-3-(5-cyano-1H-indol-3-yl)-2-methylacrylamide (12e)가 가장 활성이 우수한 유도체였다 (EC50 = 1.1 μM, and CC50=56.9 μM, SI = 56.9). 추가적인 구조 활성 상관 관계를 통한 최적화 연구를 위하여신규 유도체들을 고안하였다. 이러한 유도체들은 12e의 구조를 바탕으로 이중 결합의 치환기 변형, 벤조산의치환기 변형, 인돌 고리의 N에 치환기를 도입하였다. 따라서 indole-3-carbaldehyde (3a-j)를 출발 물질로 하여 Wittig 반응, 가수분해, 아미드커플링 반응, 알킬레이션 또는 아실레이션 또는 설포닐레이션 반응 등 총 4단계의 합성 과정을 거쳐 인돌 고리의 N 위치가 치환된 화합물 3-(N-substituted indole)2-methylacrylamide (17-43) 신규 유도체들을 합성하였다. 또한 NS5B 핵산 중합 효소 저해제로서 신규하고 높은 활성과 안전성을 갖는 유도체들에 대한 활성을 확인하여 구조-활성 상관성을 분석하였다. 그 결과, 화합물 (E)-3-(1-acetyl-5-cyano-1H-indol-3-yl)-N-(4-tert-butylphenyl)-2-methylacrylamide(41) 이 가장 좋은 활성과 안전성을 나타내었다. (EC50 = 0.47 μM, CC50 = 40.74 μM, SI = 86.68). 인돌계 화합물 41은 HCV NS5B RNA 의존성 RNA 중합 효소 저해제계열의 신규하고 가치 있는 신약 선도 물질로 여겨진다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Hepatitis C virus (HCV) is a novel human pathogen. The standard of carefor HCV infection is a combination of pegylated interferon-α and ribavirin. However, this treatment is associated with severe side effects and only half of patients benefit from this combined treatment. Recently, a rate of HCV infection is on a constant increase. Therefore, a new class of anti-HCV therapeutics is urgently needed for treatment of HCV infection. One of major targetsfor HCV infection is a viral NS5B protein, which is an RNA dependent RNA polymerase (RdRp). NS5B RNA polymerase plays an essential role in viral replication. In order to develop novel inhibitors of HCV replication via mechanistically unbiased approach, we screened ~ 6,000 compounds of our in-house library with renilla luciferase-linked genotype 2a reporter virus. We identified a series of compounds with an indole moiety as active against HCV replication. On the basis of this result, we designed three groups of novel indole derivatives as active inhibitor of HCV, and synthesized indole2-methylacrylamides (12a-j) with 3 steps such as Wittig reaction, hydrolysis, and amide coupling reaction from indole-3-carbaldehyde which were substituted or unsubstituted of indole ring (3a-j). Among tested compounds, 12e was found to have significantly enhanced HCV inhibitory activity and low cytotoxicity (EC50 = 1.1 μM, CC50 = 61.8 μM, and SI = 56.9). However, these series had a problem with water solubility, even though compound 12a, 12d-e were potent inhibitors. Thus, we wished to solve this solubility problem while maintaining antiviral activity. We further synthesized four groups of new 3-(N-substituted indole)2-methylacrylamidederivatives (17-43), which have modification of double bond, benzoic acid, and introduction of N substituentinan indole ring bysimple chemistry including Wittig reaction, hydrolysis, amide coupling reaction, and alkylation or acylation or sulfonylation from indole-3-carbaldehydes (3a-j). The structure-activity relationship (SAR) study showed (E)-3-(1-acetyl-5-cyano-1H-indol-3-yl)-N-(4-tert-butylphenyl)-2-methylacrylamide (41)was the most potent inhibitor (EC50 = 0.47 μM, CC50 = 40.74 μM, SI = 86.68) which was derived from (E)-N-(4-tert-butylphenyl)-3-(5-cyano-1H-indol-3-yl)-2-methylacrylamide (12e)(EC50 = 1.1 μM, and CC50=56.9 μM, SI = 56.9). Herein, we described our efforts towards the identification and structure–activity relationship (SAR) of novel indole derivatives as NS5B polymerase inhibitor. Compound 41may serveas a valuable candidate for development of a new class of HCV NS5B RNA polymerase inhibitors in the future.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction = 1
• 2. Materials and Methods = 7
• 2.1. Chemistry = 7
• 2.2. Biological evaluation studies = 12
• 3. Results and Discussion = 29
• 3.1. General procedure = 29
• 3.2. General procedure for coupling reaction of 2a-2f = 30
• 3.3. General procedure for Wittig reaction = 34
• 3.4. General synthetic procedure for hydrolysis = 39
• 3.5. Procedure for preparation of compound 6 and = 43
• 3.6. General procedure for preparation of indole 2-methylacrylamide analogues = 44
• 3.7. General procedure for preparation of substituted indole 2-methylacrylamide and 2-fluoroacrylamide analogues = 47
• 3.8. General procedure for N substitution of indole ring = 55
• 4. Conclusion = 67
• 4.1. Conclusion = 67
• 4.2. 1H NMR spectra = 68
• 5. References = 95