Thermotoga neapolitana 유래 초고온성 D-mannose-6-phosphate isomerase의 클로닝 및 효소특성 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mannose-6-phosphate isomerases (MPIs) have been known to catalyze versatile isomerization reactions between aldose and ketose sugars with or without phosphate groups. In the present study, a putative MPI gene from Thermotoga neapolitana DSM4359 was cloned and overexpressed in Escherichia coli. T. neapolitana MPI (TnMPI) gene, encoding 278 amino acids, shares 36-76% amino acid sequence identities with known microbial MPI genes. Recombinant TnMPI with C-terminal six-histidines was easily purified by using an Ni-NTA chromatography, and its enzymatic properties were characterized, especially for the isomerization between D-mannose and D-fructose. TnMPI can be activated by some divalent metal ions, such as Cu2+, Mn2+, or Co2+. As a result, TnMPI shows its highest activity under the reaction conditions at 75℃ in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mM Cu2+. Compared to the activity at optimal temperature of 75℃, its activity remains about 80% at 95℃. However, its activity rapidly decreases below pH 6.0 and above pH 8.5. In the presence of 1 mM Cu2+, especially, TnMPI activity on conversion from fructose to mannose is significantly enhanced up to 270% of that without Cu2+. TnMPI was characterized to be a highly thermostable enzyme, as it is originated from a hyperthermophile, T. neapolitana. In addition, its isomerization equilibrium between aldose and ketose is strongly affected by reaction temperature or pH. As reaction temperature increases from 55℃ to 95℃, its equilibrium ratio of fructose to mannose is shifted from 55 : 45 to 73 : 27. As reaction pH increases from pH 5.5 to pH 8.5, its equilibrium ratio of fructose to mannose is shifted from 49 : 51 to 68 : 32.

국문 초록 (Abstract)

Mannose-6-phosphate isomerase (MPI)는 aldose 및 ketose phosphate sugar 뿐만 아니라 인산화되지 않은 일반적인 당 사이의 다양한 이성화반응을 촉매 하는 것으로 알려져 있다. 본 논문에서는 초고온성 세균인 Thermotoga neapolitana DSM4359 유래의 MPI로 추정되는 유전자를 클로닝하고 대장균에서 대량 발현하였다. T. neapolitana MPI (TnMPI) 유전자는 278개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 알려진 미생물 유래 MPI와 36-76%의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 카복시 말단에 6개의 histidine잔기를 갖도록 재조합된 TnMPI는 Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 쉽게 정제할 수 있었고, 특히 D-mannose와 D-fructose 사이의 이성화반응을 포함한 효소적 특성을 규명하였다. TnMPI는 Cu2+, Mn2+ 또는 Co2+와 같은 2가 금속이온에 의해 활성화되었다. 결과적으로 TnMPI는 75℃, 1mM의 Cu2+를 포함하는 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)의 반응조건 하에서 가장 높은 활성을 보였다. 75℃에서의 효소활성과 비교하면, 95℃에서 약 80%의 잔존활성을 보였지만, pH 6.0 이하 또는 pH 8.5 이상의 pH에서는 TnMPI의 활성이 빠르게 감소하였다. 특히, 1 mM Cu2+ 이온 존재 하에서 fructose에서 mannose로 전환되는 TnMPI의 효소활성은 Cu2+ 미 첨가시와 비교하여 270%까지 향상되었다. TnMPI는 초고열성균주인 T. neapolitana DSM4359 유래의 효소이므로 높은 열안정성을 나타내었다. 또한 aldose와 ketose 간 이성화반응의 평형은 반응 온도 또는 pH에 의해 크게 좌우되는데, 효소반응온도가 55℃에서 95℃로 증가하면, fructose에서 mannose로의 기질평형비율은 55 : 45에서 73 : 27로 변화하며, 반응 pH가 pH 5.5에서 pH 8.5로 증가하면, fructose에서 mannose로의 평형비율은 49 : 51에서 68 : 32로 변화하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. Mannose-6-Phosphate Isomerase (MPI) 계열 효소의 종류 1
• (1) Phosphomannose isomerase (PMI) 3
• (2) GDP-mannose pyrophosphorylase (GMP) 3
• 2. Mannose-6-phosphate isomerase의 특징 6
• (1) MPI의 효소특성 6
• (2) MPI의 금속이온 의존성 7
• 3. Mannose-6-phosphate isomerase의 이용 8
• (1) 의약 분야 8
• (2) 식품 분야 13
• (3) 단당 생산 14
• 4. 연구 목적 17
• Ⅱ. 실험 재료 및 방법 18
• 1. 실험 재료 18
• (1) 미생물 및 유전자 18
• (2) 효소 및 시약 18
• 2. 실험방법 19
• (1) 플라스미드 DNA 분리 19
• (2) Polymerase chain reaction (PCR) 20
• (3) DNA sequencing 20
• (4) 대장균 내 형질전환 22
• (5) 효소활성 및 기질평형비율 측정 22
• (6) 단백질 농도 결정 23
• (7) Ni-NTA을 이용한 효소 정제 24
• (8) SDS-PAGE 분석 24
• (9) Thin layer chromatography (TLC) 분석 25
• (10) High performance anion-exchange chromatography (HPAEC) 분석 26
• Ⅲ. 결과 및 고찰 27
• 1. T. neapolitana MPI 유전자의 클로닝 27
• (1) Genome 데이터베이스 상의 다양한 MPI 유전자 비교 27
• (2) MPI 유전자의 클로닝 32
• (3) TnMPI의 DNA 염기 및 아미노산 서열 분석 34
• 2. TnMPI의 대장균 내 발현 및 정제 36
• (1) TnMPI 발현을 위한 재조합 플라스미드 제조 36
• (2) TnMPI 효소의 대장균 내 발현 39
• (3) Ni-NTA chromatography를 이용한 효소의 정제 39
• 3. TnMPI의 효소특성 43
• (1) TnMPI의 최적 반응조건 43
• (2) 온도와 pH에 대한 TnMPI의 안정성 48
• (3) TnMPI의 기질특이성 51
• (4) TnMPI의 활성에 대한 금속이온의 영향 54
• (5) 반응조건에 따른 기질평형비율 57
• Ⅳ. 결론 61
• Ⅴ. 요약 63
• Ⅵ. 참고문헌 64
• Ⅶ. 부록 78