Hairless 마우스에서 지방유래 줄기세포 배양액이 피부노화 억제에 미치는 영향 = Effect of AdMSCs-CM Treatment on Skin aging in Hairless Mice

국문 초록 (Abstract)

피부노화를 유발하기 위해 생후 7-8주령 된 암컷 SKH-1 hairless mouse 등 부위에 격일 간격으로 1주일에 3일 12주간 [1주: 60mJ/cm² (1MED), 2주: 2MED, 3주: 3MED, 4-12주: 4 MED] UVB 광량으로 조사하였다. 12주간 UVB 조사 후 (주)RNL에서 공급받은 지방유래 줄기세포 배양액을 1일 1회, 주 5일, 매회 200μl씩 4주 동안 도포한 실험에서 다음과 같은 결과를 얻었다.
표피수분 손실량은 정상군보다 대조군이 실험 전 기간 동안 유의하게 높았다. 실험 4주후 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 약71.1% 유의하게 낮았다.
피부 수분함량은 실험 전 기간 동안 대조군은 정상군에 비해 낮았다. 실험 4주 후에 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 정상군에 비해 약 33% 유의하게 낮았지만 대조군에 비해 약 23% 높게 나타났다.
피부 홍반도는 실험 전 기간 동안 대조군과 양성대조군은 정상군보다 각각 30%, 21.5% 높았고 실험 4주 후 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군이나 양성대조군보다 각각 10.9%, 8.8%감소하였다.
피부조직의 주름양상을 관찰한 결과는 대조군은 정상군에 비해 눈에 띄게 주름이 발견되고 주름 능선의 두께가 굵고 간격이 넓으며 주름이 깊게 형성된 반면, retinoic acid를 도포한 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 주름 능선의 두께가 얇고 간격이 좁으며 주름이 얕게 형성되어 있었다. 피부주름을 Visioline으로 분석에서 주름의 넓이와 수, 길이, 깊이를 측정한 결과에서 주름의 총넓이는 정상군에 비해 대조군이 약 396.6% 유의하게 넓었으며 양성대조군, 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 각각 54.8%, 36.4% 유의하게 적었다. 주름의 수에서는 정상군에 비해 대조군은 133.6% 유의하게 많았으며 대조군에 비해 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 22.7%, 12.7% 적었다. 주름의 전체길이는 정상군에 비해 대조군은 160.5% 유의하게 길었고 대조군에 비해 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 각각 39.0%, 26.8% 짧았다. 주름의 깊이는 정상군에 비해 대조군이 52.7% 유의하게 깊었고 정상군에 비해 양성대조군과 지방유래 줄기세포 도포군은 유의한 차이가 없었다.
피부조직 형태 및 염증관련 세포를 관찰한 결과는 정상군은 표피와 진피층 배열이 규칙적이며 염증관련 세포들이 거의 보이지 않은 반면, 대조군은 표피와 진피가 두꺼워졌고 표피층의 비후와 피지선의 증식이 관찰되었다. 이에 비해 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 줄어들어 있음을 확인하였다. 진피층 내 교원섬유의 양과 형태를 관찰한 결과에서 정상군은 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적이었으며 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적인 반면 대조군은 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어들어 있었다. 피부 진피층내 피부 진피층 내 탄력섬유의 변화, 소실 및 양과 형태를 관찰한 결과는 정상군은 탄력섬유가 규칙적인 반면, 대조군은 변성된 탄력섬유가 많이 관찰되었다. 양성대조군, 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 변성된 탄력섬유가 줄어들었음을 확인하였다. 진피층 및 피하층 내 비만세포의 분포양상과 탈 과립 정도를 관찰한 결과는 정상군은 비만세포가 적게 관찰되었고 탈 과립이 거의 없는 반면, 대조군은 비만세포가 현저히 많이 관찰되었고 탈 과립 정도가 심하게 나타났다. 양성대조군과 지방유래 줄기세포 도포군은 대조군에 비해 비만세포 수가 적게 관찰되었고 탈 과립 정도도 경미하게 나타났다.
적출한 피부조직에서 유해산소 대사효소 활성변동을 측정한 결과는 유해산소를 생성하는 효소인 XO 활성은 정상군에 비해 대조군은 약 64% 유의하게 높았으나, 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 정상군과 유의한 차이가 없었다. 대조군에 비해 양성대조군은 약 44% 유의하게 낮았다. 유해산소를 제거하는 효소인 SOD 활성은 정상군에 비해 대조군에서 약 77%유의하게 감소하였고 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. CAT 활성은 군 간의 유의한 차이가 없었다. 피부조직의 MMP-3 발현량을 측정한 결과는 정상군에 비해 대조군은 약 309.9% 유의하게 높았다. 양성대조군은 대조군에 비해 약 62.9% 유의하게 낮았고 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 유의한 차이는 없었으나 약 33% 감소하는 경향이 나타났다.
피부조직의 MMP-2, -9 활성도를 측정한 결과는 MMP-2는 정상군에 비해 대조군에서 1125% 유의하게 높았다. 양성대조군과 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 대조군에 비해 유의한 차이는 없었으나 각각 54.6%, 58.6% 감소하는 경향이 나타났다. MMP-9은 유의한 차이가 없었다.
체중, 식이량 및 음수량을 측정한 결과는 음수량은 정상군에 비해 대조군, 지방유래 줄기세포 배양액 도포군은 유의한 차이가 없었으나 양성대조군은 유의하게 증가하였다. 식이량은 정상군에 비해 모든 군에서 유의한 차이가 없었다. 체중은 실험기간 동안 각 군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 적출한 비장, 흉선 및 간 무게를 측정한 결과는 전 장기에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실험결과를 종합해 보면 피부노화 억제효과를 평가한 동물실험에서 자외선 조사에 의한 활성 산소의 생성을 억제하고 생성된 활성산소의 제거 촉진과 교원섬유와 탄력섬유 생성을 활성화함으로써 피부노화 억제 및 개선 효과가 지방유래 줄기세포 배양액 도포군에서 보였다. 이는 지방유래 줄기세포 배양액이 피부노화 억제 및 개선 효과에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In order to conduct an experiment with artificial induction of skin aging in experimental animal, this study applied irradiation using ultraviolet B (UVB) light to the back region of female SKH-1 hairless mice (at age 7-8 weeks after birth) every 2 days, three times a week, for 12 weeks at the variable quantity of light[1st week: 60mJ/cm2 (1MED), 2nd week: 2MED, 3rd week: 3MED, 4-12th week: 4MED]. adipose-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium (AdMSCs) was treatment to the back region for 6 days a week during 4 weeks. The duration of experiment totaled 4 weeks (6 days a week). As a result, this study came to the following findings:
It was found that control group (hereinafter called C group), positive control group (hereinafter called PC group) and E group showed significantly higher severity of skin transepidermal water loss than normal group(hereinafter called N group) throughout experimental period.
It was found that all groups showed lower water content of skin than N group throughout experimental period.
Throughout experimental period, it was found that E group showed higher erythema than N group. In particular, it was also noted that C group and PC group showed significantly higher erythema than N groups.
This study conducted Visioline analysis on skin wrinkles to measure area, number, length and depth of wrinkles. As a result, it was found that C group showed significantly wider area of wrinkle than N group, but PC and E group showed narrower area of wrinkle than C group.
For the number of wrinkles, it was found that C group showed significantly more wrinkles than N group, whereas PC, and E group showed less wrinkles than C group. It was found that C group showed significantly longer wrinkles than N group, but PC and E group showed shorter wrinkles than C group.
For whole length of wrinkles, it was found that C group showed significantly longer wrinkles than N group, while PC and E group showed shorter wrinkles than C group. For the depth of wrinkles, it was found that the wrinkle valley of N , PC and E group was shallower than that of C group.
According to observation on skin tissue morphology and inflammation- related cells, it was found N group showed regular arrangement of epidermal and dermal layer but very few inflammation-related cells, whereas C group showed thicker epidermis and dermis as well as considerably high count in dermal layer. In addition, there were thickened epidermal layer and grown sebaceous glands found in C group. It was found that C group showed significantly 110% thickness epidermal than N group.
According to observation on quantity and morphology of collagen fiber in dermal layer, it was found that N group showed relatively high density and regular arrangement of collagen fibers, and PC and E group showed higher density and more regular arrangement of collage fibers than C group, whereas C group showed significantly lower density, more irregular arrangement and less quantity of collagen fibers exposed to cellular destruction.
According to observation on variation cell loss, quantity and morphology of elastic fiber in dermal layer, it was found that N group showed relatively regular arrangement of elastic fibers, whereas C group showed relatively large quantity of degenerated elastic fibers. But it was found that PC and E group showed smaller quantity of degenerated elastic fibers than C group.
According to observation on distribution and degranulation of mast cell in dermal and subcutaneous layer, it was found that N group showed relatively small number of mast cell with very little degranulation, while C group showed remarkably large number of mast cell with relatively severe degranulation. But it was found that PC and E group showed smaller number of mast cells with lighter degranulation than C group.
According to measurement of variations in the activity of XO, a metabolic enzyme involved with production of oxygen free radicals in skin tissue samples, it was found that C group showed significantly 61.8% higher XO activity than N group, but PC and E group didn't show any significant difference in XO activity than N group.
On the other hand, it was found that C group showed significantly lower activity of SOD an enzyme involved with elimination of oxygen free radicals, than N, PC and E group. It was found that PC, E and C group showed lower CAT activity than N group.
According to measurement of MMP-3 expression in skin tissues, it was found that C group showed significantly 309.9% higher expression of MMP-3 than N group, and PC and E group showed MMP-3 expression level comparable to N group, but the former groups showed significantly 62.9%, 33% respectively lower MMP-3 expression level than C group.
According to measurement on the weight of spleen and thymus taken from mice, it was found that there was no significant difference in weight of spleen and thymus among all groups.
In conclusion, this animal experiment sought to measure quantifiable effects of AdMSCs-CM treatment on skin aging. As a result, it was found that AdMSCs-CM had positive effects on controlling and alleviating skin aging in AdMSCs-CM experimental groups by controlling potential production of oxygen free radicals formed by UVB irradiation; facilitating elimination of produced oxygen free radicals; promoting production of collagen fiber and elastic fiber. It was found that AdMSCs-CM treatment had higher effects on controlling or improving skin aging.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 = 1
• 2. 재료 및 방법 = 4
• 2.1 시약 및 기기 = 4
• 2.2 시료조제 = 4
• 2.3 실험동물 및 처치 = 5
• 2.4 최소 홍반양 측정, 피부노화 유발 및 시료도포 = 5
• 2.5 피부 TEWL, 수분함량 및 홍반도 측정 = 6
• 2.6 피부조직의 형태학적 관찰 = 6
• 2.6.1 주름양상 관찰 = 6
• 2.6.2 H&E 염색 관찰 = 6
• 2.6.3 Masson's trichrome 염색 관찰 = 7
• 2.6.4 Verhoeff's 염색 관찰 = 7
• 2.6.5 Toluidine blue 염색 관찰 = 7
• 2.7 항산화능 측정 = 7
• 2.7.1 효소시료의 조제 = 7
• 2.7.2 피부조직의 유해산소 대사효소 활성도 = 8
• 2.7.2.1 피부조직의 단백질 함량 측정 = 8
• 2.7.2.2 Xanthine oxidase(XO) = 8
• 2.7.2.3 Superoxide dismutase(SOD) = 8
• 2.7.2.4 Catalase(CAT) = 8
• 2.8 피부조직의 유전자 발현량 측정 = 9
• 2.8.1 Matrix metalloproteinase-3(MMP-3) = 9
• 2.8.1.1 RNA 추출 = 9
• 2.8.1.2 cDNA 합성 = 9
• 2.8.1.3 PCR과 전기영동 = 9
• 2.8.2 Matrix metalloproteinase-2, -9(MMP-2,-9) = 10
• 2.9 체중, 식이량 및 음수량 측정 = 11
• 2.10 장기무게 측정 = 11
• 2.11 자료 분석 = 11
• 3. 연구결과 = 12
• 3.1 피부 TEWL 변동 = 12
• 3.2 피부 수분함량 변동 = 13
• 3.3 피부 홍반도 변동 = 14
• 3.4 피부조직의 형태학적 변화 = 15
• 3.4.1 주름 양상 관찰 = 15
• 3.4.2 표피두께 관찰 = 18
• 3.4.3 H&E 염색 관찰 = 19
• 3.4.4 Masson's trichrome 염색 관찰 = 19
• 3.4.5 Verhoeff's 염색 관찰 = 19
• 3.4.6 Toluidine blue 염색 관찰 = 19
• 3.5 항산화능 비교 = 20
• 3.5.1 피부조직의 유해산소 대사효소 활성 = 20
• 3.6 피부조직의 유전자 발현량 측정 = 25
• 3.6.1 Matrix metalloproteinase-3(MMP-3) = 25
• 3.6.2 Matrix metalloproteinase-2, -9(MMP-2, -9) = 27
• 3.7 체중, 식이량 및 음수량 변동 = 28
• 3.8 장기무게 변동 = 30
• 4. 고찰 = 31
• 5. 요약 및 결론 = 36
• 참고문헌 = 39
• 부록 = 46
• 영문초록 = 54
• 국문초록 = 60