SGK1(Serum- and Glucocorticoid-Induced Kinase 1)에 의한 Fe65와 Tau의 인산화와 이들의 기능 조절 = Phosphorylation of Fe65 and Tau by SGK1(Serum- and Glucocorticoid-Induced Kinase 1) and their Function Control

국문 초록 (Abstract)

세포 신호전달과정에 대한 연구에 의하면 SGK1(Serum- and Glucocorti- coid-Induced Kinase 1)은 기질 단백질의 인산화를 통하여 세포생존에 필요한 효소들의 활성을 증가시키고, 반대로 세포사멸에 관여하는 효소들은 불활성화 시킨다고 한다. SGK1은 세포의 생존과 분열을 조절하는 중요한 핵심 신호를 전달하는 단백질이며. 직접 기질단백질 인산화를 통해 핵 내 전사요인이나 세포질 내 여러 단백질들을 활성화 또는 비활성화 시킨다. SGK1이 세포의 생존에 미치는 기능을 규명하기 위하여 SGK1의 기질 단백질을 탐색한 결과, Fe65와 Tau 단백질에 SGK1에 의해 인산화가 되는 염기서열
정보가 존재하는 것을 알게 되었다.
* 2007년 2월 박사논문임
SGK1의 기질 motif는 (R-x- R-x-x- (S/T)-φ,이며 여기에서 φ는 소수성 아미노산을 가리킨다. 따라서 이 연구의 목적은 SGK1에 의한 Fe65와 Tau 단백질의 인산화여부와 이들의 기능을 규명하는 것이다.
Fe65는 APP(Amyloid Peptide Precursor)의 C-말단과 단백질-단백질 상호작용에 관여한다. 이 단백질은 동물의 특정부위 뇌신경에서 과다하게 발현되는 것으로 유전자 발현을 조절하는 전사요인의 성질을 가지고 있다. Fe65에는 세곳의 단백질-단백질 상호작용 영역(domain)이 있는데 WW 영역과 두 곳의 Tyrosine 인산 결합부{Phospho Tryosine Binding(PTB1/PTB2) domains}, 핵수송 시그널{Nuclear Localization Sequence(NLS)}을 가지고 있는 연결자 단백질(adaptor protein)이다. Fe65는 APP 단백질 집단(protein family)의 다른 단백질들과 마찬가지로 PTB2를 통해 APP와 상호작용을 한다. 단백질서열 정보에 의하면 SGK1에 의해 Fe65 560CRVRFLS FLA569 의 Ser566 가 인산화가 이루어질 것이라 추정하고 이를 확인하기 위해 미국국립생물정보센터(NCBI)에 등록된 AY730550 변종 Fe65를 사용하고 Fe65 단백질과 형광을 붙인 Fe65 펩티드(FITC-560CRVRFLSFLA569)를 이용하여 Fe65의 Ser566 잔기 인산화를 Ser566인산화 특이항체로 증명하였다. Ser566잔기의 인산화는 위치 돌연변이 유도와 공초점 현미경분석에 의하여 SGK1에 의해서 Ser566 잔기가 인산화 된 Fe65는 거의 핵에 위치하였고, 인산화 되지 않은 Fe65 돌연변이는 주로 세포질에 위치함을 관찰하였다. 이로써 Fe65의 Ser566 잔기는 SGK1에 의해 인산화 되고 이 인산화로 인해 Fe65가 핵으로 이동하는 것을 증명하였다.
Tau는 신경세포의 소낭수송, 미세소관-세포막 상호작용 및 단백질 세포내 위치탐색과 같은 다양한 기능을 수행하는 단백질이다. SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier)는 핵으로 이동, 신호전달, 세포예정사(apoptosis), 자기소모(autophagy), 세포주기조절, ubiquitin에 의한 분해, 유전자 전사 등을 조절한다고 알려져 있다. Tau의 염기서열 정보(FKxE)에 의해 Tau 단백질에서도 SUMO 변형(modification)이 일어난다는 단서를 구하였다. 그리고 위치 돌연변이유도와 공초점 현미경 분석으로 SGK1에 의한 Tau의 S214 잔기 인산화가 이것의 K340 잔기에서 SUMO 결합을 촉진하는 것이 확인되었다. 또한 Tau S214E (analog의 point mutnat)로 340K에 SUMO결합이 일어나며 Tau 단백질이 핵 주변으로 이동하는 것을 공면역 침강(co-immunoprecipi- tation)과 공초점 현미경으로 확인하였다. 또한 Tau S214 인산화 유도체인 S214E와 비인산화 유도체 S214A, K340R 돌연변이로 실험을 한 결과 인산화 유도체인 S214E 에서 Tau 단백질이 더 안정화된다는 것이 증명되었다. 그러나, Tau의 FACS 실험 분석에 의하면 340K 의 SUMO 결합 그 자체는 세포의 생존에는 영향을 미치지 않았다. 그러므로, Tau 214S잔기(S214E) 인산화가 340K 잔기의 SUMO 결합을 촉진하고 SUMO 결합된 Tau 단백질이 세포의 핵 주변으로 이동을 하며 Tau 단백질의 안정성을 증가시키기는 것을 확인하였다. 그러나 이 일로 세포의 생존에는 별다른 영향을 주지 않는다는 결론을 얻었다.
이 연구 결과는 SGK1는 Fe65와 Tau를 인산화하며 인산화 위치는 각각 Fe65의 Ser566 와 Tau의 Ser214 잔기이고, 이들은 SGK1의 기질 motif 내에 위치하고 있음을 증명하였다. 또한 SGK1의 기질 motif 인산화가 각각 Fe65와 Tau의 세포내 분포를 조절하고 있다는 것을 나타낸다. SGK1은 기질 단백질 Fe65와 Tau를 인산화 하여 세포의 생존을 촉진하는 것으로 추정된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Literature review 17
• Ⅲ. Materials and Methods
• 1. Cell culture 23
• 2. Antibodies
• (1) Fe65 23
• (2) Tau 24
• 3. DNA constructs and site-directed mutagenesis
• (1) Fe65 24
• (2) Tau 25
• 4. Transfection and immunoprecipitation
• (1) Fe65 25
• (2) Tau 26
• 5. Phosphorylation of recombinant Fe65 27
• 6. Co-immunoprecipitation of SUMO with Tau 27
• 7. Non-Radioactive protein kinase assay 29
• 8. Double immunofluorescence microscopy
• (1) Fe65 29
• (2) Tau 30
• 9. In vitro SUMO-1 conjugation assay 31
• 10. Generation of anti-phospho-Ser566 Fe65 32
• 11. SUMO and Tau amino acid sequence comparison analysis 33
• Ⅳ. Results
• 1. Fe65
• (1) Phosphorylation of the recombinant Fe65 protein and the Fe65 peptides by SGK1 35
• (2) The Phospho 566Ser Fe65-specific antibody 38
• (3) Comparison of subcellular localization of wild type Fe65 and Fe65S566A mutant 40
• (4) Confocal microscopy with the phospho-specific antibody against the phosphorylated 566Ser Fe65 42
• 2. Tau
• (1) The Sub cellular localization of 214-serine phosphorylated Tau in COS-1 Cell 47
• (2) Tau SUMOylation in vitro 52
• (3) Confocal microscopic analysis of Tau SUMOylation 55
• (4) Confocal microscopic analysis of Tau ubiquitinization 58
• (5) Tau SUMOylation in COS-1 cell 61
• (6) Tau protein stability 65
• (7) Cell viability change 67
• Ⅴ. Discussion
• 1. Phosphorylation of Fe65 and its physiological implication 69
• 2. Phosphorylation of Tau and its physiological implication 72
• Ⅵ. Conclusion
• 1. Fe65 79
• 2. Tau 80
• Ⅶ. References 83